非编码RNA在结核病中的研究进展

朱银银 张洪英

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)导致的严重威胁人类健康的重大传染性疾病。MTB在与宿主共生存千年后已经产生一套完美的免疫逃避机制[1]，加之在抗生素广泛应用的压力下迅速产生的新耐药突变，以及新型冠状病毒肺炎(COVID-19)大流行和艾滋病蔓延等各种情况的影响，结核病的防控形势已越发严峻，亟需开发新的诊断与治疗方法。

人体感染病毒或细菌后会自发开启有效的免疫防御系统。既往关于免疫系统的研究多集中于蛋白质及其免疫特性，然而近年来发现非编码RNA (non-coding RNA，ncRNA) 也是参与人体免疫防御环节的关键调节物[2]，其通过调节机体中相关的信号通路来调控宿主抵御病毒或细菌的感染。随着测序技术的发展，大量的ncRNA在不同物种的不同生物学过程中不断地被发现。越来越多的研究表明，ncRNA在转录和转录后水平上调控宿主基因表达，这与MTB适应宿主体内环境及产生致病性有紧密联系。ncRNA可根据其长度分为小于200 nt的小ncRNA[如微小RNA(microRNA，miRNA)、环状RNA(circular RNA，circRNA)]和大于200 nt的长ncRNA(long noncoding RNA，lncRNA)[3]。这些ncRNA在MTB感染人体的过程中，不仅在它们之间相互作用，也会与其他蛋白、DNA等相互作用，从而影响结核病的发生发展。笔者现从lncRNA、miRNA 和circRNA三个角度阐述人体与MTB相互作用过程中ncRNA的研究现状，以及MTB在宿主细胞中的存活机制及致病机理，为进一步研究ncRNA在结核病诊断及治疗方面的应用及研发新型疫苗和药物诊断方法等提供依据。

一、lncRNA

ncRNA中大约有80%为lncRNA[4]，由于其缺少完整的阅读编码框而不编码蛋白质，曾一度被认为是基因表达过程中产生的“垃圾”，但后续研究表明，ncRNA不仅不是“垃圾”，反而在不同表达水平上影响着各种生物进程[5]。根据lncRNA对DNA序列的影响将其分成可调节紧密连接基因表达的顺式lncRNA和可调节远距离基因表达的反式lncRNA[6]。越来越多的研究表明，lncRNA参与癌症和心血管等疾病的发生发展[7-8]，也参与宿主对侵袭性病原体的免疫应答[9]，可从分子水平、细胞水平调控多种生物学活动[10-11]。

对lncRNA的研究为机体对MTB的免疫反应研究提供了一个新的方向。有证据表明，结核病患者中lncRNA的差异表达可通过调节miRNA信号轴调控巨噬细胞的自噬和凋亡来影响MTB的免疫应答[12]。例如，lncRNA HOTAIR下调表达后有利于特异性AT-rich序列结合蛋白1(special AT-rich sequence binding protein 1，SATB1)和双特异性MAP激酶磷酸酶4(dual specificity MAP kinase phosphatase 4，DUSP4)的转录表达，从而促进强毒性MTB的生存[13]。Chen等[14]通过基因芯片技术发现了结核病患者中有163个上调和348个下调的lncRNA，其中NR-038221、NR-003142、ENST00000570366和ENST00000422183均被qRT-PCR技术验证具有差异表达，且这4种lncRNA联合诊断结核病的敏感度为79.2%，特异度为75%。另有研究利用qRT-PCR技术对lnc-TGS1-1和lnc-AC145676.2.1-6在健康者和结核病患者中的表达水平进行分析，发现这两种lncRNA在结核病患者中的表达水平均明显下调，且lnc-TGS1-1在抗结核治疗期间的较低表达与患者中血小板减少症的发生存在相关性，这提示lnc-TGS1-1表达水平的降低有促进结核分枝杆菌潜伏感染发病的相关作用，可作为抗结核药物治疗不良反应的预测指标，但还需要更大规模不同人群的研究证实[15]。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性，其作为关键调控因子在lncRNA中发挥着重要作用[16]。有研究发现，与抗结核药物不良反应相关的lncRNA AC079767.4上的SNPrs1055229和rs12477677可能会影响肺结核临床表现，提示该lncRNA的遗传变异可能是有前途的生物标志物，可能有助于结核病诊治相关技术的发展[17]。

巨噬细胞是介导炎症免疫反应的源头，是阻抗病原体入侵人体的第一道防线。MTB是一类胞内寄生菌，主要寄生于感染的巨噬细胞内，因此机体的抗结核免疫主要依赖于细胞免疫。宿主lncRNA的表达被MTB改变以逃避宿主免疫反应[13]。田若男[18]研究发现，由基因反义链转录而成的长非编码反义RNA JHDM1D-AS1 (lncRNA JHDM1D antisense 1) 可能通过吸附miR-766-3p来调控靶基因OASL(oligoadenylate synthetase like)参与多重信号通路，促进MTB感染巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α和白细胞介素(interleukin，IL)-6，这为结核病提供了新的预测靶点。Li等[19]发现基因间长链非编码RNA环氧化酶2(long intergenic non-coding RNA cyclooxygenase 2, lincRNA Cox2)在MTB感染的巨噬细胞中明显高表达，lncRNA Cox2下调后可降低炎症调节蛋白核转录因子kB(nuclear factor kappa B, NF-kB) 和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)的表达，同时促进感染巨噬细胞的凋亡。lncRNA还可发挥海绵样作用，通过结合miRNA来调节miRNA的表达，从而作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)来调控一系列的生物过程[20]。LncRNA母系表达基因3 (maternally expressed gene 3，MEG3) 在肺结核患者中高表达，通过建立MTB感染巨噬细胞模型后发现抑制lncRNA MEG3的表达后，miR-145-5p的表达增加，同时细胞增殖能力增强和凋亡能力减弱[21]。与此类似，lncRNA心肌梗死相关转录本(myocardial infarction associated transcript，MIAT)也可通过miR-665/ULK1信号轴调控MTB感染巨噬细胞的自噬和凋亡[12]。

机体内的各类T细胞和B细胞也参与了MTB的清除过程。有研究报道，在结核病患者的T细胞中发现有1113个lncRNA表达失调[22]，在B细胞中发现有884个lncRNA表达失调[23]。Wang等[24]发现lncRNA CD224可以通过阻断CD224信号通路促进IFN-γ和TNF-α的表达，提高了CD8+T细胞的保护性免疫能力。lncRNA是免疫细胞反应和宿主-病原体相互作用的重要调控因子。不同表达模式的lncRNA通过多种机制影响T细胞、B细胞和巨噬细胞等多种免疫细胞，从而在调节宿主对MTB的免疫应答中发挥重要作用。然而，我们对lncRNA在结核感染过程中的不同作用及可能的机制和功能的认识仍然有限。

二、miRNA

miRNA是一类内生的、长度约为20～24 nt的ncRNA，其在真核细胞中广泛存在，在细胞内有重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因信使RNA(messenger RNA, mRNA)，而几个miRNA也可以调节同一个靶基因。miRNA 一般通过切割靶基因使其降解、抑制翻译或以这两种模式共同作用来参与一系列生物过程，比如细菌病原体为了促进自身在机体内持久性存活、复制而抑制宿主miRNA的表达，miRNA的失调影响宿主基因调控，从而进一步影响各种炎症因子分泌的信号通路[25-26]。

考虑到miRNA在MTB感染免疫防御过程中的重要作用，差异表达的miRNA可能影响结核感染的结果，并可能作为结核病的诊断生物标志物和治疗靶点,故使用miRNA谱作为结核病的诊断、预后或预测标记物的研究越来越多。在一项研究中，通过结核病患者血清检测发现20个上调和5个下调的miRNA，通过qRT-PCR技术的验证，发现宿主基因组编码(host-genome encoded) RNA (has-miR-146a) 和MTB基因组编码RNA (MTB-miR5) 在患者血清中明显上调，has-miR-125b明显下调，以这3种miRNA建立的诊断方法的敏感度为100%，特异度为56.67%[27]，这在结核病患者中具有极高的诊断潜力。另有研究发现，相较于病毒性脑膜炎患者的脑脊液，基因芯片检测中差异明显的hsa-miR-21-5p在结核性脑膜炎患者的脑脊液中明显上调，且受试者工作特征曲线下面积(AUC)高达85.7%[28]，可作为鉴别结核性脑膜炎和病毒性脑膜炎的潜在标志物。来自结核病患者外周血单核细胞的不同免疫细胞亚群的miRNA谱也显示这些细胞群的miRNA调控异常[29]。

绝大多数被MTB感染的个体因受到机体保护而不会发展成为活动性结核病，这一过程中T细胞具有重要的参与意义。在一项研究中发现，结核病患者、潜伏感染者和健康者的CD4+T细胞中差异表达的miRNA富集于丝裂原活化蛋白激酶信号通路、细胞外基质受体相互作用通路和病灶粘附处，这提示失调的miRNA可能参与结核病从潜伏期向活动期转化的过程[30]。与结核分枝杆菌潜伏感染的儿童相比，结核病患儿的CD4+T细胞中miR-26a、miR-29a和miR-142-3p水平均降低，这可能提示它们是MTB感染中疾病易感性和治疗效果的候选生物标志物[31]。分析结核病患者和健康者外周血单核细胞的miRNA发现，在结核病患者中与中性粒细胞相关的miR-197-3p、miR-99b-5p和miR-191-5p明显降低，与B细胞相关的miR-320a、miR-204-5p和miR331-3p则明显升高，考虑到中性粒细胞和B细胞在MTB感染期间具有重要的保护作用，认为miRNA有可能被用作诊断和治疗反应的生物标志物，并可用于治疗干预[32]。

触发凋亡途径、诱导自噬、刺激IFN-γ和TNF-α的分泌均是宿主细胞在细菌感染过程中采用的一些防御机制。MTB可诱导或抑制miRNA表达以逃避免疫应答。有研究表明，在结核病患者上调的miRNA中，miR-146a-5p、miR-21-5p、miR-99b-5p和miR-132-5p均可负调控骨髓细胞中Toll样受体(toll-like receptor，TLR)信号触发的宿主炎症通路，从而促进MTB的生存[33]；miRNA-106a则通过靶向作用于自噬相关基因ULK1(unc-51 like autophagy activating kinase 1)、ATG7(autophagy related 7)和ATG16L1(autophagy related 16 like 1)从而抑制MTB感染巨噬细胞的自噬过程和抗菌反应[34]。MTB在感染早期还可诱导肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis, TWEAK)上调，TWEAK通过激活AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)诱导自噬并促进分枝杆菌自噬体成熟，而miR-889可通过转录后抑制TWEAK表达来抑制自噬，以维持肉芽肿中的MTB存活[35]，这为结核病提供潜在的诊断标志物或治疗靶点。MTB还可通过调控感染宿主的miR-325-3p[36]或miR-125b-5p[37]来抑制细胞凋亡，一些miRNA被证实是通过调节细胞因子的产生来应对MTB感染，比如MTB脂质体甘油酯是一种主要的包膜分子，这种包膜分子可诱导巨噬细胞中的miR-125b高表达，而抑制miR-155的表达。由于miR-125b可破坏TNF mRNA的稳定，而miR-155则通过抑制含SH2的肌醇-5′-磷酸酶1(SH2-containing inositol-5′-phosphatase 1，SHIP1)的表达来稳定TNF mRNA，所以MTB脂质体甘油酯可通过破坏TNF mRNA的稳定来抑制人巨噬细胞中TNF的产生[38]。

细胞代谢的重编程如糖酵解代谢增加和宿主脂质代谢已成为控制免疫细胞反应的指导机制，促炎细胞因子产生[39]、抗原呈递[40]和细菌抑制[41]都依赖于糖酵解代谢的增加。有研究者观察到，miR-21通过靶向抑制糖酵解过程中的关键点磷酸果糖激酶(phospho-fructo-kinase-muscle isoform，PFK-m)从而限制促炎介质(主要是IL-1β)的产生、促进细菌生长[42]。另外，有研究表明，MTB诱导miR-33基因座重编程来抑制自噬，同时促进脂质体在巨噬细胞中产生以作为其营养来源[43]。

虽然miRNA在宿主抗MTB免疫应答的主要机制，如细胞因子的产生和在巨噬细胞中自噬的研究较多，但对于结核病相关的miRNA在特定免疫细胞群中的表达谱和调控作用研究较少。此外，许多研究揭示了结核病活动期间差异表达的miRNA可区分结核病与健康个体，或活动性结核病和结核分枝杆菌潜伏感染，显示了miRNA作为诊断结核病的生物标志物的可能性。尽管寻求miRNA生物标志物有可能改善结核病的诊断和管理，但目前miRNA作为结核病诊断的生物标志物证据有限。

三、circRNA

circRNA是内源性RNA，由于“反向剪接”的特殊机制，circRNA经历了一个环化过程，导致缺乏典型的末端结构，这使得它们对外切酶具有抗性[44]，同时使它们在样品处理过程中能选择性富集，因而比其他类型的RNA更适合用于诊断某些疾病，比如结核病的候选分子生物标志物[45]。另一方面，由于circRNA富集了miRNA的结合位点，间接发挥了miRNA的海绵作用，从而参与到一系列生物过程中[46]。circRNA的异常表达已在肿瘤、骨质疏松症、动脉粥样硬化和冠状动脉粥样硬化性心脏病中得到证实[47]，circ-RNA 也可能在对微生物感染的免疫反应中发挥关键作用[48]。

根据“海绵作用”机制，不同的研究者从下游信号通路入手，分析差异表达的circRNA，以识别具有潜在结合位点的潜在miRNA，并进一步识别这些miRNA的潜在靶基因。这种方法已被用于识别结核病新的circRNA候选诊断标志物[49]。Huang等[50]用circRNA微阵列和qRT-RCR分析了活动性肺结核患者与健康对照者的血浆，发现circ_0003528在结核病患者中高表达，通过与靶向抑制mRNA CTLA4表达的miR-0003528靶向结合，形成circRNA-miRNA-mRNA调节通路，从而促进MTB感染巨噬细胞的极化。在另一项研究中，通过微阵列技术发现10个显著上调的circRNA，对其中上调最高的3个circRNA(circRNA_051239、circRNA_029965和circRNA_404022)进行qRT-PCR验证，发现这3个 circRNA均具有作为结核病生物标志物的潜力[51]。

生物信息学分析表明，hsa-circRNA-103571在MTB感染期间可能与hsa-miR-29a和hsa-miR-16相互作用；对hsa-circRNA-103571匹配的miRNA靶向mRNA进行基因本体富集(gene ontology，GO)发现，hsa-circRNA-103571与自噬、脂肪酸生物合成和肌动蛋白细胞骨架调控密切相关[52]。此外，有研究表明miR-29a在非小细胞肺癌中可作为自噬的有效抑制剂，而miR-16可作为自噬的诱导剂[53]。这些观察结果表明，hsa-circRNA-103571与miRNA-mRNA相互作用可能为活动性结核病提供新的机制。

由于对circRNA在结核病发生发展过程中的功能和变化缺乏全面的研究，我们仍需要更多的研究来阐明其在MTB与宿主相互作用中的生物学作用及其作为临床指标的真正潜力。

四、总结

不同的个体对MTB的易感性存在很大的差异，而感染MTB的个体也有不同的风险进展为活动性结核病。研究人员在结核病患者血浆或其他种类生物样本中寻找生物标志物时，发现ncRNA是潜在的生物标志物，进一步研究发现部分ncRNA也有作为治疗靶标的潜力。目前对ncRNA的研究主要集中在miRNA，但对MTB感染相关的lncRNA和circRNA的研究越来越引起人们的关注。MTB感染宿主后，与宿主相互作用的生物过程形成精密而复杂的调节网络，由于ncRNA本身的复杂性，尚有许多宿主ncRNA未被发现，因此其功能和调控网络尚不清楚。此外，对于正在发现的宿主ncRNA缺乏准确的数据库，这使得研究局限于分析基因表达的差异，而相应的基因调控功能、下游靶点的识别，以及参与调控的潜在机制仍需进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献朱银银：起草和修改文章；张洪英：指导专业性知识，支持性贡献