利用特征中性丢失和非靶向液相色谱-质谱联用技术鉴定烟草中的糖苷成分

吴 琼，汪阳忠，安 彤，沙云菲，石肖楠，费 婷，吴 达，吴 婷*，杜一平

（1．华东理工大学 分析测试中心，上海 200237；2．上海烟草集团有限责任公司技术中心卷烟烟气重点实验室，上海 200082）

烟草中的糖类物质是影响烟草香气品质的重要化学成分，包括游离糖（如单糖、低聚糖、多糖等）和结合态糖苷（如黄酮糖苷、萜烯糖苷、糖脂等）。糖苷化合物是烟草中非挥发性香气的前体物质，在烟草的香气成分中扮演着重要角色［1］。已有大量文献报道，萜烯类糖苷化合物是烟草中香气前体物质的主要代表，部分组分已被开发用作烟草中提香的添加剂。黄酮糖苷类物质是烟草中大量存在的生物活性物质，在吸烟过程中可分解为风味相关的物质［2］。糖脂不仅在保润性能和改善烟叶感官上发挥作用，更是重要的卷烟香气前体物质［3］。因此，开发糖苷化合物的定性筛查和定量检测方法对改善烟草香气品质具有非常重要的意义。

飞速发展的质谱技术因高灵敏度、高分辨率以及与色谱联用的便捷性等优势在未知物结构鉴定中发挥着不可或缺的作用。采用气相色谱-质谱联用法研究烟草中的挥发性物质，并对其进行结构鉴定及定量分析，主要通过直接分析游离态香气成分或间接分析水解后的结合态香气成分来实现［4-5］。液相色谱法对非挥发性物质具有优异的分离性能，质谱法具有强大的结构鉴定和定量分析能力，因此，液相色谱-质谱联用技术具有无需水解直接分析糖苷类香气前体物质的能力，在糖苷类物质分析中占据重要地位［6-7］。同时，液相色谱-质谱技术中的串联质谱方式能提供丰富的二级碎片离子，可为糖苷化合物的结构确认提供有力的结构信息。糖苷化合物中的O-糖苷键在质谱的碰撞模式下非常容易断开而获得失去特定糖元结构的离子片段，可通过高分辨液相色谱-质谱联用技术利用特征糖元中性丢失来筛选未知糖苷化合物［1-2，8］。文献报道多数是针对一类糖苷类物质开发质谱分析方法，鲜有对糖苷化合物进行全面筛查和鉴定的研究，特别是鲜有解析糖苷配基结构的研究。

本文提出利用高分辨质谱所获得的特定糖元中性丢失对糖苷化合物进行筛选的方法，同时结合文献报道、现有数据库（mzCloud、HMDB、Lipid Maps等）和碎片离子理论计算工具鉴别烟草中各类糖苷化合物。本方法无需标准物，为烟草中各类糖苷化合物的快速和高通量筛选提供了一种新途径，为进一步研究烟草中的香气成分及其影响因素提供了重要信息。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

液相色谱-四极杆∕轨道阱组合型质谱联用仪（Ultimate 3000 & Q-Exactive plus LC-MS，美国赛默飞世尔科技有限公司）；恒温混匀仪（Thermomixer comfort，美国Eppendorf公司）；台式高速冷冻离心机（Hitachi CT15RE，日本Hitachi公司）。

甲醇、乙腈和甲酸均为LC-MS级（Fisher金标，美国赛默飞世尔科技有限公司）；实验用水均由Advantage A10超纯水机制备（18．2 MΩ·cm，德国默克公司）。

1.2 烟草中糖苷类物质的提取

将烟叶磨成粉，称取20 mg烟叶粉末，加入2 mL 甲醇-水（70∶30，体积比）混合溶液中，70 ℃加热提取30 min，以5 000 r∕min离心10 min后取上清液，用0．22 µm 聚四氟乙烯（PTFE）滤膜过滤后待分析。

1.3 液相色谱-质谱联用分析条件

烟草提取液的液相色谱分离：采用Hypersil Gold C18色谱柱（2．1 mm × 100 mm × 3 µm，美国赛默飞世尔科技有限公司）。流动相：A为含0．1%甲酸的水溶液，B为含0．1%甲酸的甲醇溶液。梯度洗脱程序为：0 ～ 4 min，10% ～ 15% B；4 ～ 7 min，15% ～ 25% B；7 ～ 9 min，25% ～ 32% B；9 ～ 16 min，32% ～ 40% B；16 ～22 min，40% ～ 55% B；22 ～ 28 min，55% ～ 95% B，维持2 min；在30．1 min回到10% B并持续至35 min。

特征中性丢失离子对的采集：采用一级质谱采集中的中性丢失模式（ISCID）筛选中性丢失离子对，设置源内裂解能量为5、10、15、20、25、30、35 eV。

非靶向定性分析数据采集：糖苷类物质的定性分析采用全扫描-数据依赖二级质谱模式（Full mass-ddMS2），其中一级质谱分辨率设置为70 000，二级质谱分辨率为17 500，采集正离子模式数据。

1.4 数据分析方法

液相色谱-质谱联用数据采集和峰提取∕搜库分别采用Xcalibur软件和Compound Discoverer 3．2（CD）实现。中性丢失的筛选采用软件MSFinder（中国科学院大连化学物理研究所许国旺研究员提供）实现，其中特征中性丢失离子对的保留时间误差小于0．1 min，中性丢失分子量误差小于0．01 Da［9］。采用mzCloud （https：∕∕www．mzcloud．org∕）、Lipid Maps（https：∕∕www．lipidmaps．org∕）、HMDB（https：∕∕hmdb．ca∕）等数据库进行化合物的结构检索。

2 结果与讨论

2.1 烟草提取液中糖元特征中性丢失的筛查

糖苷化合物在裂解时会丢失一些特征的糖元碎片［10］，本文的特征糖元中性丢失设置主要考虑戊糖、脱氧己糖、己糖、戊糖-己糖、脱氧己糖-己糖以及己二糖6种糖型，具体的中性丢失分子式和分子量见表1。综合考虑7种不同源内裂解能量（5、10、15、20、25、30、35 eV）下特征中性丢失的母离子-子离子对，在正离子模式下可筛选出所对应糖苷类物质的质荷比信息，共筛选88对具有表1中特征中性丢失的离子（保留时间大于1．5 min）。

表1 中性丢失糖元的详细信息（RT ＞ 1．5 min）Table 1 Detailed informations of specific neutral loss（RT ＞ 1．5 min）

2.2 烟草提取液的非靶向筛查

图1为烟草提取液高分辨液相色谱-质谱联用分析的总离子流图（TIC）。高分辨质谱中含有各种结合态糖苷类物质的信息，本文主要考察保留时间大于1．5 min，分子量范围为200 ～ 1 500 Da的结合态糖苷。通过Compound Discoverer 3．2软件进行峰提取和mzCloud数据库搜索，共检索到1 495种化合物。为筛查烟草中的结合态糖苷类物质，将本实验获得的非靶向筛查中的离子列表与特征中性丢失筛查得到的母离子列表绘制韦恩图（如图2），在烟草提取液中共筛选60个符合特征中性丢失的结合态糖苷类物质。其中部分通过特征中性丢失筛选出的母离子可能为某些二糖糖苷物质丢失1个单糖形成的离子，未能在非靶向筛查中找到，因此最终筛选的结合态糖苷类物质略少于特征中性丢失的母离子数目。

图1 烟草提取物的LC-MS总离子流图（m∕z 200 ～ 1 500 Da）Fig．1 LC-MS TIC of tobacco extract（m∕z 200-1 500 Da）

图2 特征中性丢失筛查与非靶向筛查得到的母离子数目的韦恩图Fig．2 Venn diagram of the numbers of parent ions between neutral loss screening and untargeted screening

2.3 糖苷化合物的结构鉴定

为进一步确认筛查的结合态糖苷化合物的结构，对60种化合物的二级质谱图进行了分析。糖元部分的结构信息可直接通过该化合物的特征中性丢失分子量及其二级谱图获取。苷元部分的结构则需利用高分辨二级质谱图推导出相应的化学式，再结合mzCloud、HMDB、Lipid Maps等数据库和文献资料确认。

图3为含有不同苷元的12种代表性糖苷化合物的二级质谱图。O-糖苷通常在糖苷键的位置进行断裂，形成B，Y离子；而C-糖苷则首先从糖元内部进行断裂，形成X，Z离子。因此根据糖元的特征中性丢失筛选的主要是含有O-糖苷键的相关化合物，而无法筛选出只含有C-糖苷键的结合态糖苷化合物［11-13］。如表2所示，通过二级质谱共鉴定出23种结合态糖苷化合物。

图3 含不同苷元的代表性糖苷化合物的二级质谱图Fig．3 MS∕MS spectra of some typical glycosides in tobacco

表2 烟草中所含有的糖苷化合物可能的结构信息Table 2 Possible structures of screened glycosides in tobacco

（续表2）

通过mzCloud数据库检索匹配获得了4个化合物的定性结果（ms2best match ＞ 90，表2中化合物3、12、13和17），均为黄酮糖苷类化合物，其中碎片离子m∕z303．048 6是槲皮素苷元的特征峰，碎片离子m∕z287．053 7对应的苷元可能为山奈酚。根据O-糖苷化合物在二级质谱图中特征中性丢失后的苷元离子信息，进一步对其他糖苷化合物进行定性分析。参考文献中的二级谱图确认了碎片离子m∕z197．116 5、m∕z269．173 5和m∕z209．152 8所对应的苷元为萜烯衍生物。其中m∕z209．152 8对应的苷元为氧代紫罗兰醇，有文献报道［14］该物质为烟草的主要香气成分之一；m∕z269．173 5对应的苷元为3，11，12-Trihydroxy-1（10）-spirovetiven-2-one（HMDB号：0038154）［15］；m∕z197．116 5对应的苷元为地芰普内酯［16-17］。通过分析化合物19 ～ 22中苷元的元素组成发现，上述化合物主要由大量碳、氢元素和少量氧元素组成，推测其可能为脂类物质，通过Lipid Maps检索该4种化合物均为固醇脂类（ST）苷元。通过分析二级碎片离子可知，化合物23为神经酰胺类（Cer）苷元，其先非特异性丢失1分子水（即［M +H-H2O］+）形成基峰离子，苷元在二级质谱图（图3L）中可见强度极高的脱水峰（如m∕z696．538 3和m∕z552．498 7）。根据神经酰胺骨架中进一步断开酰胺键丢失1分子中性脂肪酸烯酮，可推断化合物23的苷元是由C16∶0的羟基脂肪酸和C18∶2的羟基醇胺脂肪链连接而成的Cer 34∶2。图4为化合物23中苷元可能的裂解路径。

图4 化合物23的二级碎裂路径Fig．4 Fragmentation of compound 23

综上所述，在烟草提取液中共鉴定出23种结合态糖苷化合物，包括酚酸、黄酮、生物碱、萜烯、固醇脂及神经酰胺类苷元结构。根据化合物极性的不同，可发现极性较大的酚酸类糖苷出峰较早，保留时间基本在8 min之前（见图1）；中等极性的黄酮糖苷和糖苷生物碱类化合物基本位于色谱图的中间位置，保留时间为8 ～ 18 min；弱极性的糖脂化合物最后被洗脱，保留时间为18 ～ 30 min。表2中的糖苷物质通过二级质谱确定全部是O-糖苷物质，主要包括单糖苷、二糖苷和三糖苷。在筛选出表1中列举的糖元相关的糖苷时，其氨基糖元和乙基胺糖元同样被筛选出来（表2中化合物1、10和19）。

3 结 论

根据高分辨质谱可准确鉴别分子碎片的特点，利用液相色谱-质谱联用技术结合糖元特征中性丢失筛查技术，建立了烟草中糖苷类物质的快速鉴定方法，共筛选出60种糖苷类物质，并针对其中23种进行了结构确认。所筛查的糖苷类物质主要包括单糖苷、二糖苷和三糖苷，糖元部分以己糖、脱氧己糖以及两者的二糖或三糖为主。利用多种数据库检索方法，并参考文献资料进一步对苷元部分的结构进行确认，发现它们属于酚酸类、黄酮类、生物碱类、萜烯类、固醇脂类及神经酰胺类化合物等。本文所鉴定的糖苷类物质种类丰富，对烟草中香气组分研究具有重要的参考价值，为进一步研究烟草香气的影响因素奠定了基础。