真菌苦马豆素合成途径中SWN基因簇的研究进展

凯 乐，卢 萍，姜 凯，李玉玲

内蒙古师范大学 生命科学与技术学院，内蒙古呼和浩特 010022

苦马豆素（Swainsonine，SW）是由植物内生真菌、昆虫病原体真菌等产生的吲哚里西啶类有毒生物碱，其分子式为C8H15NO3，相对分子质量为173，国际上将含苦马豆素的棘豆属（Oxytropis）和黄芪属（Astragalus）植物统称为疯草。疯草是目前危害草原畜牧业最严重的毒草类型之一，牲畜采食过量疯草会引起中毒，出现食欲不振、四肢麻痹、体重下降、母畜流产等现象[1-3]。脱SW的植株是优良牧草。SW具有很强的神经毒性，是引发牲畜疯草病的唯一毒素[4]，其阳离子半椅式构象与甘露糖阳离子类似，能与甘露糖苷竞争性结合，能够竞争性抑制动物细胞α-甘露糖苷酶Ⅰ和高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ的活性，使牲畜细胞空泡变性，造成低聚糖代谢及糖蛋白合成障碍，造成细胞功能紊乱，最终失去正常功能，严重者可导致死亡[5-9]。但在医学领域，SW是研究糖蛋白N-寡糖合成的工具药。此外，还具有抗肿瘤和免疫调节作用[10-14]，由此受到广泛关注。

小花棘豆（Oxytropis glabra DC.）是多年生草本植物[15]，大部分植株含有对牲畜有毒的SW，牲畜采食过量会造成草原畜牧业重大的经济损失。卢萍等[16-17]课题组从内蒙古小花棘豆中分离出可产SW的内生真菌，被归为Alternaria属。其中，检测到含该属真菌的植株含SW，未检测到该菌则宿主植株则不含SW，因此，提出其SW毒性由Alternaria属内生真菌引起，并且体外培养的该内生真菌也检测出SW。

此外，克隆了该内生真菌酵母氨酸还原酶基因（sac）的DNA（KY052048）和cDNA (KJ944635)，并顺利得到了酵母氨酸还原酶基因敲除株Δsac。对产SW的小花棘豆内生真菌Alternaria oxytropis OW7.8及Δsac进行了转录组测序分析[18]。通过KEGG代谢途径分析，认为SW合成与萜类和聚酮化合物代 谢（the metabolism of terpenoids）、其他氨基酸代谢（the metabolism of other amino acids）、辅 因 子 和 维 生素 代 谢（Metabolism of cofactors and vitamins）、其他次生代谢物生物合成（Metabolism of cofactors and vitamins）等途径有关。随后利用第三代测序技术PacBio测序平台对内生真菌A. oxytropis OW7.8进行全基因组测序和组装，将编码 基 因 与GO、KEGG、KOG、TCDB、Secretory Protein、CAZy、cytochrome P450、PHI等数据库多个数据库进行了功能注释，寻找SW合成相关基因。预测内生真菌A. oxytropis中可能与SW合成相关的关键酶，结合此前的转录组测序分析结果，以及与他人的有关研究结果进行比较基因组学分析，进一步推测A. oxytropis中SW的合成途径与分子机制，为深入了解SW生物合成途径和代谢机制提供重要参考。

SW合成途径存在于赖氨酸分解代谢的分支中[19-20]，可被划分为3个阶段：第1阶段是由赖氨酸生成哌啶酸的过程。Ren[21]等根据基因组学的研究，推测在SW合成途径中，由赖氨酸转化为哌啶酸有2条途径，即P6C（Δ1-哌 啶-6-羧 酸） 途 径 和P2C（Δ1-哌啶-2-羧酸）途径。P6C途径由L-赖氨酸（L-Lys）经酵母氨酸脱氢酶催化生成酵母氨酸，再由该酶催化生成L-2-氨基己二酸6-半醛（L-2-Aminoadipate 6-semialdehyde），经1-哌啶-2-羧酸酯/1-吡咯啉-2-羧酸还原酶催化生成P6C，随后在吡咯啉-5-羧酸还原酶（P5CR）的催化下，转化为L-哌 啶 酸（L-pipecolic acid）；P2C途 径由L-赖氨酸经L-赖氨酸α-氧化酶催化生成6-氨基-2-氧代己酸（6-Amino-2-oxohexanoate），再环化形成P2C，经Δ1-哌啶-2-羧酸还原酶和赖氨酸-6-脱氢酶的共同催化生成L-哌啶酸（L-Pipecolate)。第2阶段由L-哌啶酸与丙二酰CoA（Malonyl-CoA）缩合生成1-酮基吲哚里西啶。第3阶段生成终产物SW。第2、3阶段的系列反应可能由SWN基因簇编码的各种酶催化。对产SW真菌基因组中SWN基因簇的基因成分和基因功能进行综述。

1 各类产SW真菌的SWN基因簇的基因组分

Cook等[22]经BLASTp和tBLASTn比对发现，部分产SW的真菌均含有SWN基因簇，包括绿僵菌属（Metarhizium）、链格孢属（Alternaria）、毛癣菌属（Trichophyton）等。该基因簇含7个基因：swnK编码一个PKS-NRPS杂合酶、swnN和swnR编码不同Rossmannfold家族还原酶，swnH1和swnH2编码不同FeⅡ/α-酮戊二酸依赖的氧化酶，swnA编码一种转氨酶。swnT编码的蛋白可能与跨膜胆碱转运载体相关。有些真菌不含swnT和swnA。Cook等[22]经研究和比对后认为，并非所有SWN基因簇都包含全部7个基因。但所有上述真菌都含swnK、swnN、swnR、swnH1、swnH2 5个基因，毛癣菌属的swnR基因独立位于距SWN基因簇较远的位置。在Ipomoea carnea endophyte (ICE)内生真菌和另一种疯草内生真菌A.oxytropis Raft Rive中不含swnA，但基因组内存在swnT的 假 基 因。A.oxytropis Raft Rive与A.oxytropis OW7.8 两菌株的SWN核苷酸序列一致度高达99%，仅有少量不同。

2 SWN基因簇各基因的功能

swnK编码一个PKS-NRPS杂合酶[23]，是一种多功能蛋白，与一般微生物的PKS-NRPS不同的是，其PKS和NRPS模块颠倒，即NRPS-PKS。swnK包括氨基酸腺苷化结构域（A）、β-酮酰基合成酶结构域(KS)、酰基转移酶结构域(AT)、β-酮酰基还原酶结构域(KR)、2个磷酸乙酯结合/硫代化结构域(T和ACP)以及可催化还原反应和非还原的Dieckmann缩合反应[22]的R结构域。Luo等推测，绿僵菌中swnK各结构域顺序为A-T-KS-AT-KR-ACP-R。编码的多功能蛋白SwnK的作用过程为：哌啶酸（L-PA）作为起始底物被A结构域识别，随后KS结构域接受上游肽酰链与下游丙二酰CoA缩合，形成C-C键，为产物增加2个碳原子，KR结构域将上游产物的酮基还原成羟基，最后由末端R结构域将醛基与氨基环化并脱水生成亚胺离子。Cook等在金龟子绿僵菌中敲除swnK，敲除株中没有检测到苦马豆素，但在swnK基因功能互补株中检测到了高于野生型绿僵菌的SW水平。推测该酶在金龟子绿僵菌的SW合成途径中起重要作用。Luo等[23]人敲除了罗伯茨绿僵菌（M. robertsii）的swnK基因，敲除株中同样没有检测到苦马豆素，再次确认了swnK是SW生物合成途径中的关键基因之一。为了探究SwnK催化产物的化学结构，Luo等[23]对该产物进行了质谱分析，最终确定该产物为1-酮基吲哚里西啶（1-oxoindolizidine）。推测swnK编码的酶在绿僵菌中以L-哌啶酸为底物，催化生成1-酮基吲哚里西啶。

swnN编码一个Rossmann-fold家族的短链脱氢酶[23]，在罗伯茨绿僵菌中，swnN基因敲除株ΔswnN的SW含量相对野生型菌株而言明显减少，但并未完全消失。且相比于野生型，该敲除株中积累了1-酮基吲哚里西啶，推测swn编码的还原酶以1-酮基吲哚里西啶为底物，催化还原反应，生成1-羟基吲哚里西啶。

swnR编码的酶也是一个Rossmann-fold家族的还原酶。罗伯茨绿僵菌的swnR基因敲除株ΔswnR的SW及所有中间产物水平均减少，认为swnR对SW的合成也有重要作用，但目前swnR调节SW的作用机理未知。

swnH2和swnH1编 码2种 不 同 的Fell/α-酮戊二酸依赖的双加氧酶，罗伯茨绿僵菌swnH2基因敲除株ΔswnH2未检测到SW，且缺少1-酮基吲哚里西啶和1，2-2羟基吲哚里西啶，但有2种能自发异构化的1羟基吲哚里西啶（1-hydroxyindolizine）含量显著升高，因此认为二者均为SwnH2底物，经NMR分析确定构型为(1S)-1-羟基吲哚里西啶和(1R)-1-羟基吲哚里西啶，推测SwnH2以1羟基吲哚里西啶为底物催化氧化反应生成1，2-二羟基吲哚里西啶（1，2-dihydroxyindolizine）。

swnH1敲除菌株ΔswnH1也未检测到SW，但有3种1，2-二羟基吲哚里西啶含量显著升高，推测SwnH1催化SW合成途径中的最后一步反应，以3种1，2-二羟基吲哚里西啶为底物催化氧化反应生成终产物SW。经HPLC分离和多步纯化后对得到的化合物进行NMR分析，确定为3种底物构型为(1S，2S)-1，2-二羟基吲哚里西啶、(1R，2S)-二羟基吲哚里西啶和(1S，2R)-二羟基吲哚里西啶。

3 展望

SW的分子结构为双杂环，并且有4种手性异构[24]。这意味着化学合成的SW极容易掺杂手性异构体，难以分离纯化。研究内生真菌中的SW合成途径，利用生物合成的方法得到SW，从而根据SW的抗肿瘤和免疫调节作用生产药物，为多种疾病的治疗提供可能性。SWN基因簇几乎存在于所有产SW的真菌中，处于SW生物合成通路的下游，以L-哌啶酸为底物经一系列反应催化生成终产物SW。

有关产SW真菌的SW合成机理和代谢途径最早在豆类丝核菌中、后来在绿僵菌中开展了一些研究，而在疯草内生真菌中研究较少。而到目前为止，对SWN基因簇相关基因功能的研究结果多在罗伯茨绿僵菌及金龟子绿僵菌中进行，而疯草内生真菌此方面的研究未见报道。本课题组前期对产SW的小花棘豆内生真菌A. oxytropis OW7.8及其酵母氨酸还原酶基因敲除株Δsac进行了转录组测序分析，对A. oxytropis OW7.8进行了全基因组测序分析，发现该真菌基因组中有SWN基因簇的5个基因，即swnK、swnN、swnR、swnH1、swnH2，在SW合成途径中催化下游反应，对SW生物合成意义重大。目前已克隆OW7.8的上述5个基因，构建了一系列基因敲除载体和表达载体，个别构建了CRISPR/Cas9基因编辑载体。上述载体分别用于OW7.8原生质体的转化，转化子筛选工作仍在进行中，以期得到基因敲除株，利用HPLC-MS技术检测各突变株中SW及关键中间产物的水平变化，深入研究相关基因对小花棘豆内生真菌A. oxytropis SW合成的影响，为进一步明晰疯草内生真菌SW合成的分子机制和代谢途径奠定基础，对通过遗传改良得无SW的优良牧草、促进草原畜牧业的发展有积极意义。