生物毒素基体标准物质研究进展

林若漫，林振华

（深圳市计量质量检测研究院，广东深圳 518000）

生物毒素又称天然毒素，是广泛存在于自然环境和食品中的一类次生代谢产物，具有不可复制、多样性和复杂性等特点，根据来源可以划分为微生物毒素、动物毒素、植物毒素以及其他毒素[1]。某些毒素具有剧毒性和致癌性，如肉毒杆菌毒素和黄曲霉毒素等，其广泛存在于食品领域。近年来，食品中生物毒素导致的中毒事件时有发生，毒素随食品进入人体内可造成恶心、腹泻、头晕、致幻、呼吸麻痹甚至死亡等症状，严重威胁着人们的身体健康。《国家卫生计生委办公厅关于2015年全国食物中毒事件情况的通报》[2]中显示，2015年，有毒动植物及毒蘑菇引起的食品安全事故占全年食物中毒事件总报告起数的40.2%，总死亡人数的73.6%。2019—2021年国内饲料原料和饲料中霉菌毒素污染调查报告显示[3-4]，采用免疫亲和柱-高效液相色谱荧光检测法对样品中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素进行测定，结果显示饲料和原料中检出一种及以上毒素的阳性率在这3年分别为99.33%、99.44%和99.51%，饲料及其原料污染霉菌情况不容乐观。主要原因是人们对有毒有害物质认知不足、食品加工过程不规范或食材储存不当，导致食品的污染或变质。因此，对食品中生物毒素的检测也成为现阶段科研人员和食品检测机构关注的重点。

由于食品基质的复杂性，食品基质效应往往会对检测方法的准确性和精密度造成一定的干扰，使用传统纯化学标准物质进行质量控制和能力评价有时难以满足检测需求，需要结合同一基质的基体标准物质对检测体系进行综合评价。基体标准物质可以有效克服基质效应引起的误差，保障检测结果数值的准确性和可溯源性。当前国内外对于基体标准物质的研究都非常重视，相比于国外，我国基体标准物质的研究起步相对较晚，针对生物毒素的基体标准物质研究更少，主要依赖进口，但国外生物毒素基体标准物质价格昂贵、货物周期长，基体标准物质的研制对保障人们的身体健康、满足市场检测和科研需求、填补我国相关技术和标准空白具有重要意义。本文将从国内外生物毒素基体标准物质研究现状、制备工艺等方面进行综述，以期为后续生物毒素基体标准物质使用者和研究者提供参考。

1 基体标准物质的概述

标准物质是一种对检测数值具有可比性和溯源性的计量标准，是分析检测工作中重要的材料或物质[5]。标准物质主要用于方法的研制和评价、建立测量的溯源性，是实验室分析测试的质量保证[6-7]。标准物质主要分为纯化学品标准物质和基体标准物质。与纯化学品标准物质相比，基体标准物质与实际样品成分尽可能保持一致[8]，可以提高测试结果和质量控制的可靠性。基体标准物质可以避免基质本身含有的活性物质与生物毒素产生反应，降低基质对测定结果造成的干扰。欧盟在法规（2002/657/EC）中规定，在分析检测过程中，需要采用基体标准物质进行过程的质量控制。以标准物质作为质量控制的手段是检测分析的关键，而制备高水平的基体标准物质保证食品检测数据的可靠性和准确性是当前食品安全的重中之重。

基体标准物质阳性样本获取一般有两种方法，自然污染阳性样本或空白基质加标法。自然污染阳性样本筛选工作量大，具有一定的盲目性，通常采用模拟毒素实际污染的途径制备阳性样品，如接种霉菌、饲喂等。基体标准物质制备过程中的主要方法有粉碎、匀浆、冷冻干燥、筛分、搅拌均匀和分装等，最后通过均匀性、稳定性、定值和不确定度评定等步骤完成研制。

2 国内外生物毒素基体标准物质研究现状

2.1 国外有证生物毒素基体标准物质研究现状

近年来，有证生物毒素基体标准物质的开发在国内外都非常重视。生物毒素基体标准物质开发方面，美国标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）和欧洲标准局和标准物质（Institute for Reference Materials and Measurements，

IRMM）以粮食、饲料、加工食品为基质，开发了多款真菌毒素基体标准品，如以脱脂花生和花生酱为基质制备的黄曲霉毒素B1基体标准物质，以全脂奶粉为基质制备的黄曲霉毒素M1基体标准物质，以玉米粉为基质制备的呕吐毒素基体标准物质。此外还有学者研制了植物毒素基体标准物质，如以油菜籽为基质制备的硫代葡萄糖苷基体标准物质。加拿大国家研究委员会（National Research Council Canada，NRC）计量研究中心是研制海洋生物毒素有证标准物质种类最多且获全球公认的机构，开发的产品如以贝类为基质的失忆性生物毒素基体标准品和腹泻性生物毒素基体标准品等。

2.2 国内有证生物毒素基体标准物质研究现状

在国内有证标准物质唯一官方公布平台“国家标准物质资源共享平台”上，关于食品中生物毒素的基体标准物质中一级标准物质7种，二级标准物质52种，涉及化合物包括黄曲霉毒素、腾毒素、伏马毒素、细交链孢菌酮酸、玉米赤霉烯酮、河豚毒素、赭曲霉毒素、呕吐毒素等，其中涉及化合物最多的为黄曲霉毒素B1，有23种，占目前公布总数的39.0%，涉及的食品基质占比最多的为玉米粉，有14种，占比23.7%[9]。此外，还有玉米/花生调和植物油、糙米粉、大米粉、小麦粉、奶粉、花生酱、葡萄酒、织纹螺肉和河豚鱼肉等。

2.3 黄曲霉毒素类基体标准物质研究现状

黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFTs）是由黄曲霉和寄生曲霉菌产生的高毒性、低分子质量的双呋喃环类毒素，最常见和最主要的黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2，其他黄曲霉毒素均是这4种毒素的衍生物，如哺乳动物误食含有黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）的谷物饲料后，在其体内经过羟基化作用衍生转化成黄曲霉毒素M1[10]。这类毒素中以黄曲霉毒素B1毒性最大，且是已知的化学物质中致癌性最强的一种[11]，被列为I类致癌物，广泛存在于土壤和各级农产品中，主要污染花生、玉米、小麦等粮食谷物，并通过食物链影响人们的身体健康[12]。李丽等[13]通过对全国各代表性区域种植的玉米进行筛选，经粉碎、混匀后制备了均匀性和稳定性满足要求的基体标准物质，定值含量为（27±3）μg·kg-1，并获批为国家二级标准物质，为我国粮食中黄曲霉毒素B1的检测和鉴定提供计量标准。

基体标准物质的均匀性和稳定性一直是研制过程的重点和难点。张磊[14]选择以黄曲霉菌接种的花生替代天然污染的花生，为降低基体活性采用高温高压和γ射线辐照灭菌，为了提高黄曲霉毒素B1基体标准物质的稳定性采用了添加稳定剂、双层包装、高抗性花生作为原料，同时通过将样品粉碎至微米级以及添加乳化剂的方式以提高标准物质的均匀性，为后续基体标准物质的制备提供了一套完整的制备工艺流程。

当前针对黄曲霉毒素的检测方法和有证标基体准物质主要集中在玉米、花生等作物中，而对于以这些作物为原料的饲料中黄曲霉毒素的检测技术研究较少，也缺乏相应的基体标准物质。为弥补这一空白，赵天天等[15]以玉米为饲料原料，向其中添加黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标准溶液，混匀后对样品进行干燥、辐照灭菌、分装和真空包装最终制得饲料中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2基体标准物质，经定值分别为（71.23±1.60）μg·kg-1、 （75.53±1.28）μg·kg-1、（74.87±1.79）μg·kg-1和（75.77±2.68）μg·kg-1。

黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2主要存在于粮食谷物中；黄曲霉毒素M1和黄曲霉毒素M2主要存在牛奶和相关乳制品中，其中黄曲霉毒素M1性质稳定，不仅耐高温也耐酸碱，因此含有黄曲霉毒素M1的牛乳被用于制备婴幼儿奶粉会导致奶粉中黄曲霉毒素M1含量不合格[16]。魏敏等[17]通过给牛喂养被霉菌污染的饲料方式，获取含有黄曲霉毒素M1的牛奶乳品，制备了满足检测要求的乳粉中黄曲霉毒素M1基体标准物质，定值结果为（2.45±0.41）μg·kg-1，并获批为国家二级标准物质，对保障我国乳品质量具有重要意义。

2.4 伏马毒素类基体标准物质研究现状

伏马毒素是一种霉菌毒素，主要是由轮状镰刀菌（Fusarium Verticilllioides）、串珠镰刀菌（Fusarium Moniliforme）等在一定条件下产生的水溶性代谢产物，被列为2B级致癌物。目前，伏马毒素已发现A、B、C和P四大类，伏马毒素B1、伏马毒素B2和伏马毒素B3最为常见，其中伏马毒素B1（Fumonisin B1，FB1）毒性最强，污染最多，广泛存在于小麦、水稻、高粱以及玉米等粮食作物中。伏马毒素具有极强的热稳定性，在普通加工过程中其性质和结构均能保持稳定，因此伏马毒素污染不仅影响粮食产量，还会通过食物链进入人体，威胁健康[18]。孟佳佳等[19]通过将产毒镰刀菌接种到玉米培养基中的方式，获得了含有伏马毒素B1和伏马毒素B2的阳性基质样本，通过粉碎混匀，并采用空白玉米粉进行逐级稀释，成功制备了一批均匀性和稳定性符合要求的玉米粉中伏马毒素B1和伏马毒素B2基体标准物质，经定值分别为（1.07±0.09）mg·kg-1和（0.43±0.07）mg·kg-1，为我国谷物质量安全风险评估提供技术支持与物质保障。进口标准物质价格昂贵、货物周期长，为替代进口标准物质，填补国内在玉米粉中伏马毒素基体标准物质研制的空白，牛欣宁等[20]通过将玉米样品放置在伏马毒素B1的标准溶液中浸泡，经过冷冻干燥制备成基体标准物质，定值为 （1475.56±169.98）μg·kg-1，可用于实验仪器校准及实验过程质量控制等。

2.5 呕吐毒素类

呕吐毒素（Deoxynivalenol，DON）又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇或脱氧瓜萎镰菌醇，为镰刀菌产生的有毒代谢物，在小麦、玉米甚至肉和奶制品中都有检出[21]，长期摄入对血液和免疫系统均会产生影响[22-24]。 针对目前国内外谷物中检出频率最多、污染最普遍的真菌霉素——呕吐毒素，许娇娇等[25]在国内首次以天然污染的食品面粉为候选物，经均质、分装、灭菌、定值，为保证存放和运输过程中的稳定性，使用Co-60γ射线进行照射灭菌，成功研制了均匀性和稳定性符合要求、定值为（2366±187）μg·kg-1的呕吐毒素基体标准物质，为后续国内开展食品中呕吐毒素的监测数据的准确性提供保障。

2.6 交链孢霉毒素

交链孢霉属（Alternaria）是一类广泛分布于土壤和农产品中的真菌，农作物感染后会发生腐败。交链孢霉代谢产生的毒素统称为交链孢霉毒素（Alternaria Toxins），其中以细交链孢菌酮酸（Tenuazonic Acid，TeA）和腾毒素（Tentoxin，TEN）污染最为常见。谢继安等[26]以天然污染交链孢霉毒素的小麦样籽粒为基体，通过对全国各产区代表性样品进行筛查，分别选取了来自安徽的天然污染低浓度和山西省的天然污染高浓度细交链孢菌酮酸和腾毒素小麦籽粒样品作为候选物，通过磨粉、过筛、混匀、辐照灭菌等制备了两种不同浓度的小麦粉中细交链孢菌酮酸和腾毒素基体标准物质，均获批国家二级标准物质，同时也是国际上唯一的以天然污染细交链孢菌酮酸和腾毒素的小麦粉基体标准物质。

2.7 赤潮毒素

赤潮毒素是由海洋中存在的赤潮藻类产生的具有生物活性的物质，具有难防治、反应快、毒性大等特征。目前已知的有十几种，根据中毒症状和传递媒介类型主要可以分为神经性、麻痹性、记忆缺失性和腹泻性贝毒以及西加鱼毒。其中麻痹性贝毒是分布最广、危害最大的一类赤潮毒素，也是最早被发现的贝毒，是一种由鞭毛虫和蓝细菌引起的强效神经毒素[27]。腹泻性贝类毒素是海洋广泛分布的一些引发赤潮的生物分泌的一类聚醚或大环内酯化合物，常见的如软海绵酸（Okadaic Acid，OA），该类毒素中毒症状以呕吐和腹泻为主。近年来，有毒有害赤潮在我国近海海域发生规模和次数均呈不断增加的趋势，阻碍了水产行业的发展。

由于腹泻性和麻痹性贝毒化学结构比较复杂，难以通过化学合成方式获取。桂文锋[28]通过向扇贝投喂塔玛亚历山大藻和利玛原甲藻，通过仪器持续检测发现内脏是扇贝毒素积累的主要部位，用塔玛亚历山大藻和利玛原甲藻分别喂食到7 d和4 d后体内毒素超过安全限量值，将贝肉和内脏取出，匀浆，冷冻干燥后制备成均匀性和稳定性符合要求含麻痹性贝毒和腹泻性贝毒的基体标准物质。HIGMAN等[29]也通过向贝类喂食亚历山大藻，确定了实验室条件制备麻痹类贝毒基体标准物质的可行性。为保证腹泻性贝类毒素检测结果的可靠性，傅博强等[30]采用空白基质加标法，以紫贻贝为原料，将软海绵酸溶液添加到肉浆中，冷冻干燥后粉碎、混匀制备成均匀性和稳定性符合要求的软海绵酸基体标准物质，经定值为（2.96±0.50）μg·g-1；王秋艳等[31]则采用自然基体污染法经测定腹泻性贝类毒素阳性的贻贝，经冷冻干燥等工艺制备基体标准物质，定值为 （8.83±0.60）μg·g-1，该方法原料成本更低，可以用于腹泻性贝类毒素检测过程质量控制等。WANG等[32]通过对贝毒产生条件，如时间、温度、营养物和盐浓度等条件进行了优化，经过35 d培养后收获了含有鳍藻毒素-1和软海绵酸的干藻粉，经定值分别为21.6 mg·g-1和15.2 mg·g-1，可为后续水产养殖行业中相关毒素的监管提供技术支撑。

2.8 河豚毒素

河豚毒素（Tetrodotoxin，TTX）最早由日本学者从河豚鱼的卵巢中发现，是一种广泛存在于某些脊椎和无脊椎动物体内的一种非蛋白质、高活性的神经毒素，可麻痹人体神经中枢和血管中枢，危及生命[33]。目前，河豚毒素的检测主要采用纯品标准物质作为质量控制和添加回收[34]。王伟等[35]首次报道以野生河鲀鱼的精巢、卵巢、肝脏以及肌肉组织为基体，通过正己烷脱脂分离处理，采用两次冷冻干燥程序制备了均匀性和稳定性符合要求的河豚毒素基体标准物质，定值结果为（5.20±0.03）mg·kg-1，可用于对水产品中河豚毒素的检测过程进行质量控制。

3 结语

食品中生物毒素是导致食品安全问题的关键环节。生物毒素基体标准物质对于食品中生物毒素分析检测的可靠性具有非常重要的意义，但生物毒素在生物体内的含量普遍较低、污染部位不均匀、难以获取特定目标含量的阳性样品是阻碍生物毒素基体标准物质制备的关键点。我国生物毒素基体标准物质无论从种类还是数量上都无法满足市场需求，主要集中在真菌毒素和海洋生物毒素类基体标准物质上，存在大量的空白，应该扩大毒素和基质种类的范围，提高基体标准物质研制水平，以满足我国科研和检测市场需求，提高检测结果的可靠性。