浅析食品微生物检验样品的采集和制备

王真祯

（南平市食品药品检验检测中心，福建南平 353000）

食品微生物检验主要是开展样品的采集、制备、检验等工作，通过检验分析出食品中的微生物或毒素，将其作为判定食品安全性的重要指标。食品检验样品的采集与制备工作是微生物检验的重要前提，对于检验报告的出具以及检验结果的准确性具有重要意义，因此做好检验样品的采集与制备工作尤为重要。

1 食品微生物检验概述

食品微生物检验可以有效防范人畜共患病的发生，是衡量食品是否符合食用标准的重要指标之一，也是判定食品能否食用的科学依据。通过食品微生物检验，可判断出食品的真实卫生情况，能对食品的被污染程度做出合理的推断。因此，严格控制食品微生物检测各个环节，能够显著减少食品安全问题，对食品安全、人类健康、经济发展起着重要 作用。

2 食品微生物检验样品的采集工作要点

对食品微生物检验样品进行采集，需要保证采样的随机性与代表性，通过微生物检验分析产品质量是否达到标准。因此，在样品采集工作中，要选择具有代表性的样品，且取样器件必须根据产品的类型、状态予以确定。

2.1 明确样品采集要求

在开展样品采集工作前，需要明确采集要求，提前做好准备，主要包括以下7点。①在提取样品前需要先确认货和证完全符合。②取样过程中应避免水、空气、光照等不良因素的影响，防止样品受到污染。③样品采集过程中使用的注射器、剪刀、采血管等均需经过高温杀菌处理，确保采样过程中无任何污染。④通常采取随机抽取方式采样，如果对样品存在微生物污染情况高度怀疑，可进行集中采集。⑤样品采集前后，在样品容器上粘贴标签，标明样品的来源、名称、采样时间和数量等详细信息[1]。⑥样品采集是微生物检验工作中不可缺失的步骤，实验室必须提前保存记录资料和程序操作，如样品采集程序和取样工作人员相关信息，甚至还要涵盖设备、环境、采集地等信息。⑦完善样品采集计划，通过实施计划促使样品替代整个批次的产品，确保采集抽取机会一致。

2.2 科学确定采样点

在食品微生物检验样品采集过程中，采样点的确定会直接影响样品采集质量，因此对于采样点的选择要覆盖食品生产到销售的全过程，从而能够通过检验结果判定哪个环节导致食品出现微生物污染[2]。从当前采样工作情况来看，样品采集点主要有如下3个。①食品原材料处。对食品原材料进行采样，常见的有原料、水、添加剂等。②食品生产线。对食品生产过程中的关键节点开展样品采集工作，如半成品或原胚等，主要为了掌握食品生产中微生物的变化情况；③食品仓储。主要对食品存储、运输环节中的微生物变化进行采样检验。通过科学确定这3个采样点，开展针对性微生物样品采集工作，能更精准了解不同环节下的食品状况，判断引发微生物污染的具体环节。

2.3 合理应用采样方法

样品采集方法需要结合食品类型、状态、有无外包装等因素确定合理的采样方法。从食品包装来分，可分为以下两种情况。①包装食品采样。针对开袋即食型小包装食品，为避免交叉污染，要尽量取原包装，在检验之前不能开封；针对大包装的液体食品，在采样之前先混合，再用灭菌棒进行混合均质；针对大容器包装的冷冻食品，则要对多部位实施无菌采样，同时保证始终处于冷冻状态。包装食品的采样要保证同一个批次和数量适中，且符合微生物检验标准。②非包装食品采样。此类食品涵盖现场制作的散装食品，具有一定特殊性，采样时要保证及时性与针对性。具体来讲要从多个部位实施无菌采样，同时将各个样品装入不同容器中。针对散装食品的采样要遵循“三层五点”原则，即对表层、中层、下层的5个点进行采样。对生产过程中的食品要进行检验批次的合理划分，分别进行取样[3]。从食品状态来分，可分为以下两种情况。①液态食品采样。液态食品的采样比较简单，通常采样时只需进行无菌混合，可连续或间歇搅拌，待匀质后采样即可。②固态食品采样。鱼肉类食品要进行内外两层采样，其中内层采样要避免与表层出现交叉污染。对鲜肉要用灭菌工具采样，冷冻食品无需解冻，直接用灭菌电钻深层采样。

2.4 包装密封样品

食品微生物检验样品采集完成后，要对其进行完全密封的包装处理，必须从采样点开始进行封装，直至送进无菌实验室，且途中要尽可能避免无关人员与样品接触，提高样品检验结果的可靠性。通常会用专门的粘胶对样品进行密封包装，放置在特定容器中保存好，做好详细信息记录。

3 食品微生物检验样品的制备工作要点

样品制备是食品微生物检验的重要工作，是获得准确的检验结果的基础。因此，制备处理过程一定要严格遵守制备要求和实验室无菌操作标准。

3.1 液体样品制备方法

对于液体样品可充分摇动液体，使样品中的微生物分布均匀，然后用灭菌吸管提取25 mL液体样品，与225 mL蒸馏水或生理盐水混合，形成1∶10的样品稀释液。需要注意的是，吸管伸入样品的深度不能大于2.5 cm。如果样品已开瓶或开罐，必须做好表面的消毒工作，严格按照无菌操作要求进行操作。对于含有CO2的液体饮料先将样品液体倒进已经杀菌完成的小瓶中，瓶口用灭菌纱布盖住，轻微摇晃，等没有气体产生后再开展检验工作。酸性食品需用10%灭菌的NaCO3调节pH值至中性后才能开展检验。

3.2 半固体样品制备方法

样品无法用吸管直接吸取，可用灭菌容器称取样品25 g，加入225 mL 45 ℃的灭菌生理盐水或蒸馏水中，此类样品溶化后必须第一时间检验。从样品稀释到接种，切记不能超过15 min。

3.3 固体食品样品制备方法

固体食品的处理过程比较复杂，具体处理方法有如下4类。①捣碎均质法。将100 g或以上的样品捣碎并混合均匀，从样品中称取25 g投入装有225 mL 稀释液的无菌均质中，匀速混合1 min。此方法对大多数食品样品有效。②剪碎振摇法。将100 g或以上的样品剪碎并混合均匀，从样品中称取25 g进一步剪碎，放入带有225 mL稀释液和一定量玻璃珠（直径为 5mm左右）的稀释容器中，将瓶盖封住，快速振摇60次。③研磨法。将100 g以上的样品剪碎并混匀，称取25 g投入无菌钵中进行充分研磨，研磨后放入带有225 mL无菌稀释液的稀释瓶中，充分摇匀。④整粒振摇法。有自然保护膜的颗粒状样品，可直接称取25 g整粒样品投入无菌稀释瓶中，重复上述振摇操作[4]。

3.4 特殊样品的制备方法

样品制备对食品微生物检验的结果精准度有直接影响，由于一些食品本身的物化表现、对微生物的抑制作用、酸碱性等存在特殊性，因此对于食品微生物检验样品的制备方法要根据其特点进行操作。①对于酸性或碱性的样品，先将稀释缓冲样液的酸碱值调成中性。②对于大蒜、洋葱等高抑制物质或腌渍食品、酸碱性食品等，可采取缓冲蛋白胨水或其他稀释液。③对于可可粉、奶粉等样品，可适当地调整温度和时间。④对于高脂肪样品，可根据脂肪水平，在稀释液中加入适量的聚山梨醇酯80，以促进乳化。⑤对于冷冻样品，置于实验室18～27 ℃ 温度下，最多不超过3 h，在2 ℃左右不超过24 h。

3.5 样品制备运输

食品微生物检验样品不能存放太久，且不同食品样品对环境的要求也有显著区别，因此在对样品进行制备的过程中，需要结合现实情况对环境合理把控。例如，若样品容易变质，工作人员需将其放置在干燥环境中，同时避免阳光直射，温度最好控制在-4～0 ℃，且尽快进行检验；若是贝类食品，从样品采集、运输、制备，再到最后的检验工作环节，整个过程用时不能超过6 h；若是干制食品，工作人员要用塑料袋进行密封保存，防止与空气中的水分接触，这类食品应当在7 d内完成检验[5]。

4 样品中微生物的检验方法

食品微生物检验方法多种多样，不同被检样品适用于不同的方法原理，通过对不同的检验方法进行深刻了解，能够为精准检验出食品微生物夯实基础。微生物检验方法有以下几种。①抗体检验。此方法应用较为广泛，在大量的抗体检验方法中，最常见且应用最便捷的是酶联免疫吸附法。它主要是利用了酶联免疫吸附方法对金黄色葡萄球菌的高敏感性，因此在金黄葡萄球菌这一微生物的检验中得到大量应用。②免疫技术检验。该检验方法主要利用了抗原、抗体之间的特定结合反应，借助病原体的催化作用生成大量免疫球蛋白，实现对食品微生物的检测。该方法对肉毒梭菌、弯曲杆菌等病原菌的检测有着良好效果。结合工作经验来看，免疫学技术法有精准度高、操作便捷、无需分离样品等优点，但同时也存在假阳性过多、灵敏度低等不足，因此在选择此检验方法时，需要根据实际情况合理确定。③电阻电导测定法。该方法主要是基于溶液导电率进行测定，能够有效检验食品微生物的含量，利用蛋白质、糖类等大分子物质与氨基酸等小分子物质存在导电度差异的特性，合理计算出微生物含量。④快速酶促反应及代谢产物检测法。其原理是利用细菌的高度繁殖过程产生的霉菌与指示剂反应测定微生物的数量。⑤快速检验法。此检验方法大部分已经商品化，常见的有染色成像计数法和ATP生物发光法。染色成像计数，即对细胞染色，测定样品中的活菌数量，主要用到紫外线显微镜与荧光过滤膜，活细胞与死细胞分别呈现荧光橙和荧光绿。此方法的检测时长约0.5 h，如果样品中的细菌数量太少，则要适量增加细菌数量。ATP生物发光法的原理是混合荧光素与ATP，将微生物的ATP转变为荧光信号，再根据荧光值判断微生物数量。此检测方法需 1.0 h左右，且如果微生物数量偏少，还要适量增加微生物。从效果来看，两种方法只能对微生物数量进行检测，无法分辨微生物种类。⑥分子生物法。该方法最常用的是核酸探针方法（即通常所说的基因探针技术）以及聚合酶链式反应技术。其中，核酸探针方法主要利用了基因最小分子脱氧核糖苷酸分子结构中碱基的特异性配对，用对应细菌的已知DNA序列实施同位素标记操作，添加至解旋过后的待测DNA样品中，根据所得双链DNA数量来判断菌种数量和种类，很好地解决了微生物检测的特异性以及敏感性问题[6]。

5 微生物检验过程中存在的不足及完善对策

在样品采集与制备过程中，存在样品存放的环境和仪器设备监管不到位，检验样品的采集不具有代表性，样品制备的设备不够完善，食品微生物采集、制备操作不够规范等问题。为了改善这些问题，微生物检验操作需要注意以下要点。

5.1 培养基质量控制

加强样品存放和检验过程中的环境质量控制，进一步完善管理制度与规范实验流程，从而实现实验室的规范化、科学化管理，以高质量检验活动提高实验室的检验水平。其中，需要重点关注培养基的质量控制，培养基无法单独开展技术验证，而需要依据微生物实验的详细标准展开评估，因此检验单位必须参照《实验室质量控制规范》中的相关标准开展建设实验室的工作，且在日常检验中严格遵守《微生物检测理解与实施》中关于培养基的管理细则。对培养基的检测可选用干热加压灭菌法，也可选用湿热加压灭菌法。

5.2 重视实验室仪器设备的日常管理

在微生物检验中，检测设备最为关键，会对检验结果的精准性造成直接影响。例如，在检验易挥发的样品时，可采用干冰冷冻粉碎机对样品进行冷冻粉碎。无菌实验室的换气系统必须达到洁净厂房的等级要求，实验室内部的墙壁、底板、天花板连接处必须带有一定弧度，地面进行防滑处理，保证仪器设备、桌椅设施的整洁度，避免实验人员和仪器设备、样品等出现碰撞受损的情况。实验室内有大量的设备设施，如水浴箱、培养箱、灭菌高压锅和灭菌箱等，都需要做好日常维护保养工作，定期进行清洁与消毒，确保设备的性能完好。每一次维护保养都需要进行调试记录，并保存好相关 资料。

5.3 加强实验人员的培训和管理

实验人员是实验室作业中容易出现不规范操作的主要因素，为了规避实验人员采用不合理的操作方法，或是因为重复实验多次而对无菌操作观念有所忽视，则一定要提高实验人员的能力和思想意识。食品微生物的检验工作具有专业性、技术性特点，对从业者的专业素养要求非常高，可在单位内部定期开展技术人员培训工作，保证每一位实验人员均具备相应资质。对实验人员的操作规范进行严格规定，保证对样品的收集、制备及实验操作均符合规定标准。此外，非实验人员非必要不得进入无菌实验室，必须进入时则要严格按照规定穿戴个体防护品。检验单位应当在无菌实验室外设置醒目的警示标志，用以增强实验人员的安全防护意识。

5.4 加强无菌室管理

必须保证微生物检验作业在无菌环境中进行，确保所有设备设施、作业条件均达到检验标准，门窗、走廊、样品区、管理区、清洁间等均需符合《实验室生物安全通用要求》规定的防护等级标准，对无菌室进行日常消毒，用紫外线灯进行照射灭菌，保证室内干燥且清洁。在开展检验工作之前，应当选择臭氧消毒法对实验室内部空气中的微生物进行全面消杀，将无菌室封闭后，注入臭氧，浓度控制在 20 mg·m-3左右，静置消杀35 min最优，再进行臭氧排放操作，浓度降至0.2 mg·m-3，随后开展食品微生物的室内检验工作。

6 结语

综上，食品微生物检验作为保障食品安全的关键环节，且微生物污染有着广泛性、随机性的特点，因此对检验工作要求较高。在食品微生物检验中，样品的采集与制备属于必要工作，其规范程度直接关系到检验结果的精准度，因此必须保证全程无菌操作，避免样品被污染。样品采集需保证代表性、时效性、完整性，样品制备需要在严格条件下进行，防止出现污染和变质。样品采集与制备工作的规范性和精准性是确保检验结果客观性、公正性的前提，可为实验结果提供保障，提升食品检验单位的权威性和专业性，为广大消费者的食品安全保驾 护航。