基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在乳品微生物中的应用进展

金佳佳，严家俊＊，綦 艳，姚丽锋，张 娟，黄翠莉，吴思敏，庄艺协

1 广东产品质量监督检验研究院，广东佛山 528300

2 拱北海关技术中心，广东珠海 519015

0 引言

乳品中存在丰富的营养物质，可以为微生物生长提供有利的环境，在贮存、运输、加工、销售等各个环节都极易发生腐败和污染，是乳品在供应保障中的关注焦点[1]。微生物中的腐败菌，如变质奶油甜品中的蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）、凝固酶阴性葡萄球菌（Coagulase negative Staphylococcus）、肠球菌（Enterococcus）和明串珠菌属（Leuconostocspp）等，会引起乳品发生化学、物理变化，直接或间接产生有害物质，造成乳品失去原有的功能活性和营养价值，是乳品腐败变质的重要因素，其不仅对食用者的健康和生命安全造成一定的威胁，同时也给乳品行业造成了巨大的经济损失[2]。微生物中的致病菌由于不会改变乳品的感官特性，污染乳品不易被察觉，且除了致病菌自身及其代谢产物会损害机体健康，其代谢过程也会对机体造成一定程度的损害[3]，因而相对于腐败菌危害更大。常见的致病菌包括沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌O157、单核细胞增生李斯特菌、产气荚膜梭菌等[4]。

1 乳品微生物分析技术的概述

乳品中微生物分析涉及定量和定性分析，也是对乳品质量进行判断衡量的重要技术手段[5]。传统微生物法主要通过表型鉴定技术进行分析，例如观察培养基中微生物的生长形态、革兰氏染色试验和生理生化反应试验等。该方法存在步骤复杂，具有一定的主观性，且检测时间长等缺陷[6]。

现如今，乳品中微生物的分析方法随着科学技术的发展有了很大的进步，如免疫学检测方法和分子信息学检测方法。免疫检测方法包括酶联免疫法、免疫磁珠法、单克隆抗体法和荧光免疫分析法等。分子生物学检测方包括PCR-DGGE指纹技术、实时PCR（定量PCR、qPCR）技术、ARISA指纹图谱技术、限制性内切酶分析（REA）、16SrDNA序列分析技术和聚合酶链式反应（PCR）等。上述方法在微生物的分析上具有较高的准确性。然而，检测过程仍然耗时耗力，对实验室条件、检验人员专业知识要求高，且需要较高的成本，难以满足大批量样品的检测需求。蛋白组学分析技术是应用于微生物快速分析的一种新型技术，该技术相对于上述方法具有快速、稳定、准确、灵敏以及成本低等特点[7～9]。

2 蛋白质组学分析技术

蛋白质组学分析技术是一种可以在特定环境和时间条件下对细胞、组织或生物体中蛋白质进行分析的技术手段[10]，主要涉及样品的制备、蛋白质的分离、蛋白质的鉴定和生物信息学分析[11]。目前最常用的蛋白质组学分析方法是质谱（MS）方法，该方法通过分析经特异性蛋白酶（如胰酶）水解后得到的肽段混合物来鉴定蛋白质。其中基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和电喷雾离子化质谱（ES）使用频率较高[12]。

3 MALDI-TOF MS 概述

MALDI-TOF MS是近几年来逐渐发展起来的一种新型蛋白质组学分析技术。现如今，已用于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌、创伤弧菌、分歧杆菌、霉菌和酵母的常规鉴定和分型。该技术在细菌鉴定中的应用已将十分成熟，还可用于细菌同源性分析和耐药性检测等，具有操作便捷、成本低、耗时短、高通量、对检验人员要求不高等优点，因此，该技术在临床实验室逐渐得到认可和推广[13]。

3.1 MALDI-TOF MS 的原理

MALDI-TOF MS主要由基质辅助激光解吸电离离子源（MALDI）和飞行时间质量分析器（TOF）两部分组成。在进行MALDI-TOF MS分析时，首先将样品均匀涂抹于金属靶板上，加入基质混合后形成含蛋白质分子和其他细胞化合物的基质共结晶薄膜。然后将处理好的样品放入分析室，在激光束的作用下，解吸和电离样品中微生物的基质分子和蛋白质。经此过程产生的电离分子在电场作用下加速飞过飞行管道，由于它们的质荷比（m/z）不同而相互分离。MALDI-TOF MS系统根据不同质量离子到达检测器的飞行时间生成肽质量指纹（PMF）的特征光谱。再通过各种算法分析图谱峰型数据，并与数据库中的已知微生物蛋白指纹图谱进行比对，从而确定该未知微生物的种类[14]。该方法可以在属、种甚至菌株的水平上识别微生物。

3.2 MALDI-TOF MS 的优缺点 [15-17]

随着国内外学者对MALDI-TOF MS的研究越来越多，MALDI-TOF MS分析技术得到了不断的完善。与传统方法依据微生物的表型鉴定方法不同，MALDI-TOF MS分析技术主要是依据微生物的蛋白质结构进行鉴定。因而，相对而言该技术有以下优点：（1）操作简单，实验人员只需经过简单的培训就能进行操作；（2）效率高。单个样品分析只需不到1 min，（3）高通量，一次可同时进行384 个样本的分析；（4）成本低，单个样本分析只需1～2 元，远低于其他方法。（5）准确度高，可以分析结构复杂的蛋白质混合物，同时实现单样本中多种微生物的鉴定。分析精度可达到种水平和某些亚种水平；（6）样品需求量少，微量样品（1 个菌落，105 个细胞）即可进行分析实验，对于某些难以培养的微生物，只需单个克隆就可以进行鉴定；（7）发展潜力大，微生物数据库决定了方法的分析范围，因而随着数据库的不断扩充，MALDI-TOF MS可根据数据库分析越来越多罕见的微生物。

目前，质谱仍有一定的局限性：（1）对于系统发育相关性高的微生物难以区分，如大肠埃希氏菌和志贺氏菌；（2）受数据库更新的影响，对于一些少见、罕见微生物的鉴定方面效果较差，或无法检测；（3）设备成本高。这些仍有待进一步的研究及改进。

4 MALDI-TOF MS在乳品微生物鉴定和分型中的应用

乳酸菌在食品工业中的经济价值十分重要。宋丹靓敏等[18]使用MALDI-TOF MS法与16S rDNA序列分析法，对于乳酸菌鉴定的准确性以及微生物系统分类学相关分析结果进行比较，结果表明，15 株乳酸菌，只有2 株存在种水平差异，其余鉴定结果一致；MALDI-TOF MS分析所得的聚类分析图和16S rDNA分析所得的系统发育树，在科水平上一致，但在属中水平上存在一定差异；MALDI-TOF MS法在乳酸菌鉴定方面有着快速、准确的优势，但仍需要通过优化算法和扩充数据库才能建立准确的系统发育相关性。

乳酸菌食品中污染菌计数的难点在于对计数琼脂上菌落的鉴定，并快速准确的区分。采用传统的生物化学方法鉴定乳酸菌，操作繁琐且准确性低。因此，凌莉等[19]采用MALDI-TOF MS鉴定技术对平板计数琼脂、不含糖的计数琼脂上菌落进行鉴定，通过比较发现，PCA上的菌落既有乳酸菌，又有非乳酸菌，在CASF平板上生长的菌落属于乳酸菌食品中的污染菌；MALDI-TOF MS与不含糖计数琼脂结合，可准确快速的对乳酸菌食品中污染菌进行计数和鉴定。

周千渝等[20]以标准菌株为模式菌，优化了对鉴定结果存在影响的菌株培养条件、基质溶液配比、点样方式以及溶剂处理方法等条件，建立了MALDI-TOF MS快速测定5 种致病菌的方法，并考察了方法的稳定性、重复性和检测限，结果表明，所优化的方法稳定性良好，检测限为106～109 CFU/mL，与16S rDNA测序法鉴定结果进行比较，83%在种水平一致，94%在属水平一致。

郑秋月等[21]应用MALDI-TOF MS对不同宿主、不同地区来源及不同血清型的74 株沙门氏菌进行肽指纹图谱数据的相似性和差异性分析，结果表明，MALDI-TOF-M S对沙门氏菌具有很好的溯源能力，但溯源结果可能受血清型的影响。应结合血清型进一步完善MALDI-TOF-MS溯源分析方法。

Wenjing等[22]利用MALDI-TOF MS和主成分分析建立了一种用于致病菌鉴定的全细胞方法，研究发现，直接应用MALDI - TOF MS分析全细胞细菌，无需提取蛋白质，具有丰富的峰含量和较高的重现性。MALDI-TOF MS 与 PCA 相结合是一种有前途的快速鉴定食品中病原体的方法。这项研究在快速识别食品中的病原体方面具有巨大的应用潜力。

孟令缘等[23]选取210 株沙门氏菌和18 株金黄色葡萄球菌，使用MALDI-TOF-MS、16S rDNA测序和VITEK全自动细菌鉴定系统进行鉴定，比较3 种方法的鉴定水平和效率，结构表明，3 种方法鉴定210株沙门氏菌属水平一致性均为100.0%；16S rDNA测序鉴定18株金黄色葡萄球菌属水平为100.0%，其中15株（83.3%）菌可到鉴定种水平；MALDI-TOFMS和 VITEK可将18 株（100.0%）金黄色葡萄球菌鉴定到种水平；MALDI-TOF-MS鉴定耗时最短、效率最高。

虽然单增李斯特氏菌的发病率不高，但其致死率高达20%～50%。20世纪90年代，世界卫生组织（WHO）已将其列为食品四大致病菌之一[24]。王耀等[25]使用MALDI-TOF-MS技术快速鉴别单增李斯特氏菌，基于实验收集的37 株单增李斯特氏菌分离株独特的蛋白质指纹图谱，创建了一个数据库。该数据库鉴定结果的可信度很高。他们还提出MALDI-TOF-MS可作为脉冲场电泳分型方法的补充方法，二者结合使用可扩大基因型对亚种水平的分型能力。

Boultifat等[26]认为，食品工业中任何微生物鉴定技术的首选条件是准确性，其次是操作简单、快速且成本低，才能确保产品安全并识别其微生物污染。他们在乳品公司生产线的不同步骤收集的巴氏杀菌牛奶样品中分离出了5 种细菌。用MALDI-TOF MS 方法进行分析，并将结果与16S rDNA 测序结果进行比较，以此确认鉴定的有效性。这项研究表明，与16S rDNA 基因测序相比，MALDI-TOF MS是一种高度灵敏、快速的方法，可用于鉴定乳制品行业的病原体。

相对于细菌和酵母，MALDI-TOF MS鉴定丝状真菌的传统预处理方法更加复杂，需加入乙醇、甲酸、乙腈以及离心提取蛋白质，这是MALDI-TOF MS无法广泛应用于丝状真菌鉴定的主要原因。Peng等[27]使用甲酸夹心法将中国湖北省三家大型综合医院收集的148 株临床丝状真菌分离株处理后，使用Vitek MS和Autof MS两种MALDI- TOF MS数据库进行鉴定。通过比较FA夹心法与传统提取法的难易程度可知，甲酸夹心法是一种更方便、省时、省试剂、灵敏的前处理方法，适用于丝状真菌的预处理和MALDI - TOF MS鉴定。

5 结论

MALDI - TOF MS是一种操作简单、准确、经济、高通量且高效的微生物分析技术。其鉴别能力高于16S rDNA 测序等其他分子生物学方法，分析精度可达到种水平和某些亚种水平，因此越来越多的应用于乳品中细菌、丝状真菌和酵母菌等微生物进行鉴定和分型。各种微生物在乳品工业生产中应用广泛，使用MALDI-TOF MS对这些微生物菌株的全面分析将有助于乳品发酵过程中菌株的快速鉴定或对微生物菌株的质量进行有效控制，此外还可以快速识别可能导致乳品变质或食物中毒的微生物，保证食品质量与安全。现阶段，MALDI-TOF MS数据库的数量和大小还无法满足一些少见、罕见微生物的鉴定或分型需求。随着研究的深入和数据库的不断扩充，MALDI-TOF MS可识别的微生物将会越来越广泛，MALDI-TOF MS在乳品微生物鉴定中的作用必然会越来越重要。