RNA治疗和基因编辑技术在肝脏疾病中的应用

曾婉嘉 吴昱 陈香梅 鲁凤民

作者单位：100191 北京大学基础医学院病原生物学系暨感染病中心(曾婉嘉，吴昱，陈香梅，鲁凤民)；北京大学人民医院肝病研究所

肝脏是重要的代谢器官，不仅在碳水化合物、脂质及蛋白质代谢中起关键作用，同时可以将各类营养物质转化为身体必需物质，并承担血液的过滤、净化及解毒等重要功能。肝功能障碍会导致肝脏特异性和全身性疾病，其中遗传性代谢病多为单基因突变引起的常染色体隐性遗传病，部分可采用酶替代疗法，但其应用范围较小，容易产生中和抗体。而某些疾病只能通过肝移植进行治疗，存在肝脏来源少且需要术后长期监护等问题；病毒性肝炎引起的肝纤维化、肝硬化及肝细胞癌等也是重要的肝脏相关死亡原因，其中慢性乙型肝炎(CHB)尚缺乏有效的治愈药物，且患者发展为终末期肝病的风险较高。因此，亟需新型的靶向肝脏的治疗方式予患者更多选择。

由于肝脏具有大量分泌蛋白的功能和运输潜力，同时也是遗传载体在体内递送时主要富集的场所之一，因此成为当前基因治疗技术的理想靶器官。传统的基因治疗多采用腺病毒载体(AAV)进行基因补充，但存在循环中和抗体等潜在问题。近年来，治疗性RNA及基因编辑技术已成为一类新的治疗手段，在很多临床试验中都获得了令人鼓舞的结果，同时也在肝脏疾病中开展了相关研究，但还有很多问题函待解决[1]。本文主要探讨了近期包括信使RNA(mRNA)递送、小分子干扰RNA(siRNA)和反义寡核苷酸(ASO)在内的RNA疗法，以及不同基因编辑策略的临床研究最新进展，这些研究为发病率高且选择有限的罕见遗传代谢病和难以治愈的慢性肝病的治疗提供了新的方向。

一、RNA治疗

RNA除了具有携带肽链编码信息的作用以外，在调节基因表达、剪接其他RNA和运送氨基酸构建蛋白质等方面也发挥着重要功能。现有的RNA治疗方案基于其生物特性研发，大致可分为三类：递送mRNA表达目的蛋白、RNA干扰(RNAi)技术靶向沉默mRNA和RNA适配体靶向调节目的蛋白，现主要介绍mRNA递送及RNAi疗法的基本原理及临床应用现状。

(一)mRNA递送 mRNA作为带有负电荷的大分子无法自由穿过细胞膜，而真核细胞内吞的mRNA通常积累在溶酶体中无法进行翻译。因此，为了避免mRNA被内环境中的核糖核酸酶降解，并促进其进入靶细胞的胞浆进行翻译，形成具有治愈功能的目的蛋白，具有保护作用和定向运送功能的递送载体不可或缺[1]，如脂质纳米颗粒(LNPs)及细胞外囊泡等。 LNPs是目前发展最成熟的递送手段之一，可用于递送mRNA、siRNA、DNA及基因编辑复合物等，通常由四部分构成：可电离阳离子脂类、磷脂(多为磷脂酰胆碱)、胆固醇和聚乙二醇脂[2]。可电离阳离子的脂类具有在酸性条件下质子化而在中性条件下呈电中性的特点，有利于在体外酸性条件下包装核酸，并促进LNPs与肝细胞的酸性内体膜融合从而释放内容物。此外，电中性的状态可以防止静脉给药时诱发免疫反应，同时也能提高向肝细胞递送的效率[3]。磷脂是LNPs结构的基本骨架，与胆固醇一同被称为辅助脂，具有稳定LNPs结构的作用，也有研究证明，辅助脂成分的修饰能起到增加递送效率或改变细胞靶向的作用[4]。聚乙二醇脂在避免LNPs早期被吞噬细胞捕获方面发挥了重要作用，故被称为隐形脂，同时还与LNPs的大小和体内循环的半衰期相关[5]。除LNPs外，细胞外囊泡也可递送核酸、氨基酸以及蛋白质等，其作为天然囊泡相对于LNPs具有更好的生物相容性和更低的免疫原性。此外，不同细胞来源的细胞外囊泡具有异质性，并展现出独特的功能，如来自血细胞的细胞外囊泡具有穿越血脑屏障的功能，而来自骨髓间充质干细胞的细胞外囊泡呈现出抗炎和旁分泌特性。细胞外囊泡的这些特点使其具有靶向运输和重复给药的潜力，但目前在细胞外囊泡的分离提纯和装载效率方面还需要进一步优化[6]。

许多遗传性肝脏代谢病均源于基因突变导致的蛋白质功能异常，如人线粒体甲基丙二酰辅酶A变位酶(hMUT)缺乏或功能缺陷可引起甲基丙二酸血症(MMA)，而葡萄糖6-磷酸酶(G6Pase-α)缺乏则会导致糖原贮积症1a(GSD1a)。有研究在MMA小鼠模型中递送hMUT mRNA进行治疗，成功地在小鼠肝脏内检测到了具有酶活性的hMUT蛋白，显著改善了重症MMA小鼠的生存和生长情况，同时血清中甲基丙二酸含量降低，但仍高于野生对照组[7]。另一项利用装载人G6PC mRNA的LNPs治疗G6Pase-α基因敲除小鼠的实验也观察到了类似结果，即治疗组小鼠在禁食后血糖相较未治疗组显著升高，但仍未完全达到野生小鼠水平[8]。目前利用mRNA治疗MMA(NCT04899310)的 I/II期临床实验已在进行中，治疗GSD1a的项目(NCT05095727，尚未招募)也计划评估成年患者静脉注射MTX-LNP-hG6Pase mRNA的安全性、耐受性和有效性。

(二)RNAi治疗 RNAi技术的策略是靶向沉默致病基因或病毒基因组来实现治疗目的，包括siRNA及ASO等疗法。siRNA源自秀丽隐杆线虫，是一种含有20～25个核苷酸的双链非编码RNA，其在细胞质中可与RNase III 核酸内切酶、Argonaute蛋白和RNA结合蛋白相互作用并去除过客链，随后产生成熟的RNA诱导沉默复合体(RISC)。而RISC可结合与siRNA引导链互补的靶mRNA，并通过Argonaute蛋白诱导mRNA降解、mRNA polyA尾去腺苷酸化直接抑制翻译等多种机制实现基因沉默。将siRNA靶向递送至肝细胞最常用的修饰手段是耦联N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，其高度特异性能最大限度地减少全身性siRNA暴露，减少输注反应并延长给药间隔[9]，目前已有多种siRNA药物进入临床试验阶段。近期，Vir Biotechnology公司宣布了VIR-2218的最新试验结果，在接受最高剂量组合疗法48周后，有30.8%的CHB患者体内检测不到乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，并伴有抗-HBs血清转换，提示宿主长期暴露于高水平病毒抗原时的免疫抑制微环境可被siRNA部分逆转。至于该系统的疗效是否持久，停药后是否会反弹等问题还有待后续的临床试验进行探究[10]。

ASO是长度为15～25个核苷酸的单链核酸聚合物，可以不依赖递送系统而是通过受体介导的途径进入肝细胞，它不需形成复合体即可单独通过互补核苷酸与目标mRNA结合，经由RNAse-H介导剪切目标mRNA或抑制5’帽形成并阻断核糖体亚基附着来发挥沉默功能。由于ASO在细胞质中积累，其相对于积累在细胞内体中的siRNA需要更频繁且大剂量地给药。另外，尽管递送载体对ASO并非必需，但结合GalNAc后可增强肝细胞靶向性，并减少全身性暴露[9]。Bepirovisen是一种用于治疗CHB的ASO类药物，其靶向位点为HBV X蛋白开放阅读框的中段，因此具有靶向所有HBV RNA的能力。近期公布的一项包含了457例样本的IIb期临床研究结果表明，持续使用Bepirovisen治疗24周后，9%～10%的CHB患者在接下来长达24周的时间内HBsAg和HBV DNA均低于检测下限[11]。此前的研究显示，接受Bepirovisen治疗的CHB患者出现了血清ALT的一过性升高，提示可能存在免疫激活并清除感染肝细胞的过程[12]。

二、基因编辑技术

基因组编辑技术依赖于基因组序列的靶向和特异性修饰，可分为无核酸酶和核酸酶引导两类。前者的原理是基于与靶标区同源的长DNA序列，通过同源重组引入所需的编辑，特异性和安全性均较好，但是编辑效率通常较低；后者则是利用核酸酶在靶标区诱导DNA双链或单链断裂，与前者相比编辑效率大大增加，但也可能出现在靶标外的基因组区域发生脱靶编辑的风险。转录激活物样效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)及CRISPR/Cas系统等都是经过了深入研究的基因编辑技术，可构建用于临床前实验的体外模型和动物模型，也可用于开发各种疾病的治疗方法，目前应用最广泛的是CRISPR/Cas9系统。

(一)基因插入及校正 现有的基因编辑技术可以通过治疗基因的插入、基因校正及基因敲除等手段靶向治疗肝脏疾病。将治疗基因靶向插入白蛋白的基因座后，可利用肝脏中白蛋白启动子的强大转录活性来治疗因分泌型蛋白缺乏引起的遗传性疾病，如血友病A、血友病B及黏多醣贮积症。其中，GeneRide系统的原理是递送携带治疗性转基因且侧翼序列与白蛋白基因座3’端同源的重组AAV载体，从而诱导基因精准整合到白蛋白终止密码子上游，并通过一个具有自切割功能的蛋白酶序列使得两种蛋白分别产生。该方法可以避免核酸酶的非靶向修饰及AAV基因组的随机整合，但是低编辑效率也限制了其应用范围[13]。基于核酸酶的基因编辑系统具有靶向特定的DNA序列并发挥切割活性的功能，为了提高同源定向修复(HDR)率并改善治疗效果，研究者将GeneRide系统与靶向插入位点的CRISPR/Cas9系统联合，在先天性葡萄糖醛酸转移酶缺乏症小鼠模型中将编辑效率提高了20～50倍，给药后小鼠的肝脏组织学、炎症标志物和血浆白蛋白水平均正常，且预测部位未观察到脱靶效应，进一步增加了其临床应用潜能[14]。尽管HDR介导基因座插入的效率较低，但通常足以实现治疗水平的蛋白分泌，且该策略在校正后的肝细胞具有生长优势时可以发挥较大的价值。同时，HDR还可用于编辑肝细胞基因组，以纠正致病突变，理想情况下可以实现无痕编辑，即将突变序列恢复成野生型序列。例如，α1-抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)可通过HDR校正突变基因，防止突变型α1-抗胰蛋白酶的积累，且校正后的肝细胞具有存活优势[15]。但是，鉴于当前的HDR系统编辑效率普遍偏低，相关研究多为概念验证。

(二)基因敲除 基于核酸酶的基因编辑系统主要是通过在目标区域诱导DNA双链断裂，并在后续的非同源末端连接(NHEJ)修复过程中引入随机的DNA插入或缺失(InDel)。这一机制可被用于引入编码区的无义突变，编辑后的mRNA衰减最终会导致蛋白敲除。该系统已被用于底物还原疗法，通过降低有毒代谢物的水平来治疗因酶缺乏导致有毒代谢物积累的疾病，如抑制上游产生毒性代谢物的酶以治疗原发性高草酸尿症等代谢性疾病。有报道显示，靶向草酸合成代谢途径上游酶的AAV8-CRISPR/Cas9载体在小鼠体内给药后可以有效抑制酶活性，防止草酸过度产生，使得肝脏中的草酸水平出现治疗性降低，避免肾脏损伤[16]。除了靶向宿主基因，CRISPR/Cas9系统还可有效降解病毒基因组，如HBV的复制模板共价闭合环状DNA(cccDNA)。有学者通过模拟微小RNA(miRNA)的生成过程，整合双向导RNA(gRNA)介导的CRISPR/Cas9系统和RNAi技术，构建了gRNA-(miR-HBV)-gRNA三联表达框架，不仅能高效破坏cccDNA，同时还可干扰病毒RNA的功能，从而促进HBV清除[17]。

(三)碱基编辑器 通过导入外源的修复模板，CRISPR/Cas9系统也可以实现HDR介导的精确编辑，但是由于编辑效率较低，其应用相对受限。Cas9蛋白的核酸酶切割活性来源于RuvC和HNH结构域，将这两个保守的核酸内切酶结构域进行突变后可以得到无切割活性，但仍保留靶向功能的dCas9(dead Cas9)蛋白。DNA碱基编辑器就是利用CRISPR/dCas9系统联合不同类型的脱氨酶实现碱基转化，包括胞嘧啶碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，其中CBE可以完成胞嘧啶向胸腺嘧啶的转换，而ABE则能实现腺嘌呤到鸟嘌呤的突变。 碱基编辑器在治疗肝脏疾病中已有诸多应用，如编辑胆固醇相关基因及HBV基因组等。靶向编辑人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(hPCSK9)基因可以在肝脏特异性hPCSK9敲入小鼠中有效降低胆固醇水平，且与基因组编辑相比，碱基编辑更为精确，未发现脱靶编辑或染色体易位[18]。除了在肝脏代谢疾病中的应用，碱基编辑器同样适用于靶向抑制病毒复制。此前，Beam Therapeutics公司在细胞水平利用胞嘧啶碱基编辑器在HBV基因组的多个位置引入终止密码子，有效抑制了病毒复制的各项指标。近期，他们公布了最新的HBV感染小鼠体内实验结果，利用LNP递送的多重碱基器导致小鼠血清HBsAg水平下降超过2 log10 IU/mL，同时HBV DNA水平下降了3 log10拷贝/mL，且在停药后没有出现病毒学反弹，为CHB患者的功能性治愈带来了希望[19]。

三、总结

基于mRNA和RNAi的疗法以及各类基因编辑技术是近年来基因治疗领域的重要突破，为不适用酶替代疗法和无法接受肝移植的遗传代谢病患者，以及缺乏有效治愈手段的慢性肝炎患者提供了更多可供选择的治疗方案。这些治疗系统的有效性和安全性已在部分动物模型上得到验证，但仍然需要更多的临床试验数据来进一步评估。如CRISPR/Cas9系统仍存在一些安全性问题，主要是脱靶编辑效应和针对Cas9蛋白的免疫反应[20]。未来通过采用经改进后的高保真Cas9蛋白、优化瞬时递送系统如LNPs和细胞外囊泡等，将可以有效避免CRISPR/Cas9系统的脱靶效应和免疫原性[21-23]。相信随着与基因编辑技术和RNA疗法相关的研究不断深入，这些技术未来一定会在临床应用中发挥更大的价值。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。