加减指迷茯苓方对胶原诱导性关节炎大鼠关节病变及滑膜VEGF/FLK-1 mRNA表达的影响

邱明山　林双杰　张少红　李依寒　钱丽霞　李良成　陈进春

【摘 要】目的：觀察加减指迷茯苓方对胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠关节病变及滑膜组织血管内皮生长因子（VEGF）和血管内皮生长因子受体（FLK-1）mRNA表达的影响，探讨加减指迷茯苓方对CIA的作用及其机制。方法：选用SPF级Wistar大鼠32只，随机选取8只作为空白对照组，其余24只采用尾根部及脊背部皮内注射牛Ⅱ型胶原乳化剂，7 d后加强免疫。造模成功后，将CIA大鼠随机分为模型对照组、雷公藤多苷组（7.81 mg·kg^-1灌胃）、加减指迷茯苓方组（31.68 g·kg^-1灌胃），每组8只。空白对照组和模型对照组大鼠灌服等体积的生理盐水。4组均连续灌胃30 d，每日1次。饲养期间测量大鼠体质量、踝关节肿胀度，治疗30 d后进行关节彩超评价，实时定量聚合酶链式反应法检测关节滑膜VEGF、FLI-1 mRNA水平。结果：与模型对照组比较，雷公藤多苷组和加减指迷茯苓方组大鼠关节炎指数评分、彩超超声表现分级（Szkudlarek）评分（关节积液、多普勒血流、滑膜增生、骨质侵蚀4个方面），以及关节滑膜的VEGF、FLK-1 mRNA表达水平均明显降低（P < 0.01或P < 0.05）。结论：加减指迷茯苓方可抑制CIA大鼠关节炎症，抑制滑膜VEGF和FLK-1表达。

【关键词】 类风湿关节炎；胶原诱导性关节炎；指迷茯苓方；血管内皮生长因子；血管内皮生长因子受体；大鼠

Effect of Modified Zhimi Fuling Formula（指迷茯苓方） on Arthropathy and Synovial VEGF/FLK-1 mRNA

Expression in Collagen induced Arthritis Rats

QIU Ming-shan，LIN Shuang-jie，ZHANG Shao-hong，LI Yi-han，QIAN Li-xia，LI Liang-cheng，CHEN Jin-chun

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of modified Zhimi Fuling Formula（指迷茯苓方）on

arthropathy and synovial VEGF/FLK-1mRNA expression in collagen induced arthritis rats（CIA rats），and to explore the effect and mechanism of the formula on CIA.Methods：Thirty-two SPF Wistar rats were selected.Eight rats were randomly selected as the blank control group，and the other twenty-four were injected with bovine typeⅡcollagen emulsifier intradermally at the tail root and back of the spine.After 7 days of intensive immunization，CIA rats were randomly divided into a model control group，a tripterygium wilfordii polyglycosides group（TWP group with 7.81 mg·kg^-1gavage），and a modified Zhimi Fuling Formula group（MZFF group with 31.68 g·kg^-1gavage），with eight rats in each.The rats in the blank control group and the model control group were perfused with the same volume of normal saline.All the four groups were given gastric perfusion for 30 days，once a day.The body mass and ankle swelling of rats were measured during the feeding period.After 30 days of treatment，the joints were evaluated by color ultrasound，and the level of VEGF/FLI-1 mRNA in synovium of joints was detected by real-time quantitative PCR.Results：Compared with the model control group，the arthritis index score，Color Doppler Ultrasound Szkudlarek score（joint effusion，Doppler blood flow，synovial hyperplasia，bone erosion），and the expression level of VEGF/FLK-1 mRNA in the synovium of the rats in the TWP group and the MZFF group were significantly reduced（P < 0.01 or P < 0.05）.Conclusion：Modified Zhimi Fuling Formula can inhibit joint inflammation and the expression of VEGF and FLK-1 in synovium of CIA rats.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;collagen induced arthritis;Zhimi Fuling Formula（指迷茯苓方）;vascular endothelial growth factor;vascular endothelial growth factor receptor;rats

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是临床上最常见的自身免疫性疾病，好发于中老年人，女性发病率较高［1］。RA基本病理表现为增生性滑膜炎、血管翳形成，并逐渐出现关节软骨及软骨下骨破坏，最终导致关节畸形和功能丧失［2］。而血管内皮异常增生是RA滑膜炎和血管翳的基础，血管增生受血管生成刺激因子及抑制因子的双重调节，即血管生成平衡假说。当血管生成刺激因子异常增高时，这种平衡被打破，出现病理性血管增生。RA血管病理性增生中最重要的促血管形成因子是血管内皮生长因子（VEGF）。研究发现，VEGF在RA患者滑膜组织及血浆中高表达，与疾病活动性相关并加重疾病发展［3］。血管内皮生长因子受体（FLK-1）是VEGF在内皮细胞发挥作用最为重要的受体，在生理及病理性血管生成中发挥着关键作用［4］。

RA属中医学“痹病”中“顽痹（尪痹）”范畴，正气不足、感受六淫邪气而致营卫气血失调、痰浊瘀血内生是痹病的基本病因病机［5］。以活血法、化痰活血法为主的中医药治疗研究较多，但单纯的化痰法在该领域研究较少。因此，笔者观察以化痰法为依归的加减指迷茯苓方对CIA大鼠关节及滑膜VEGF和FLK-1表达的影响，探讨化痰法对RA的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用SPF级Wistar大鼠32只，雄性，体质量（200±20）g，购自厦门大学动物实验中心。实验动物生产许可证号SCXK（沪）2012-0002。适应性喂养1周。

1.2 药品与试剂 加减指迷茯苓方（胆南星16 g、茯苓8 g、生姜8 g、枳壳4 g、芒硝2 g）来自厦门市中医院中药房（购自康美药业）。雷公藤多苷片（福建汇天生物药业有限公司，批号20140901，规格10 mg）；牛Ⅱ型胶原（美国Chondrex公司，批号20021，4 ℃储存）；完全弗氏佐剂（美国Sigma公司，F-5881）；FLK-1以及CD34抗体（博士德生物制品有限公司）；cDNA合成逆转试剂盒（Thermo Fisher Scientific，K1622）；TransStart Top Green qPCR SuperMix（TransGen Biotech，K10225）；二氨基联苯胺（DAB）染色液（福州迈新生物技术开发公司）；水合氯醛、多聚甲醛（美国Sigma公司）；冰醋酸（西陇化工股份有限公司）。

1.3 模型制作及动物分组 无菌条件下，牛Ⅱ型胶原在0.01 mmol·L^-1冰醋酸中充分溶解，配成质量分数为2 mg·mL^-1，放置4 ℃冰箱备用；再与等体积的弗氏完全佐剂充分混匀用玻璃注射器在冰上充分乳化，终末质量分数为1 mg·mL^-1，乳化时间约3 h；取一小滴悬浊液滴入烧杯水中，悬浊液未分散开来表示达到理想的乳化结果。32只SPF级Wistar大鼠，随机选取8只作为空白对照组，其余24只造模。取0.2 mg牛Ⅱ型胶原乳化剂在大鼠尾根部及脊背部分一侧前中后3点皮下注射，7 d后在尾根部及脊背部皮下内注射0.1 mg牛Ⅱ型胶原乳化剂加强免疫1次。免疫14 d后，将造模大鼠随机分为模型对照组、雷公藤多苷组（TG组）、指迷茯苓方组（FL组），每组8只。

1.4 造模成功判定标准 实验大鼠造模过程中，每隔6 d进行双后肢关节炎指数评分（AI评分），在初次注射牛Ⅱ型胶原乳化剂的第12天开始出现部分大鼠单侧或双侧踝关节红肿，第14天所有大鼠出现双侧踝关节红肿，根据AI评分进行模型成功评判。0级，无关节红肿；Ⅰ级，小趾关节肿胀；Ⅱ级，趾关节及足趾关节肿胀；Ⅲ级，踝关节以下足爪肿胀；Ⅳ级，包括踝关节在内的全部足爪肿胀。每只大鼠单肢评分最高4分，四肢累计得分为AI评分，最高16分，AI评分≥4分被认定造模成功，AI评分 < 4分从实验中剔除。

1.5 中药煎煮及浓缩

1.5.1 中药煎煮 煎煮时，取加减指迷茯苓方药10剂剂量，放置于3000 mL水中浸泡30 min；先用武火煮沸，再改用文火，煎煮25 min之后倒出；第二煎加入2000 mL水，煎煮20 min倒出，与头煎药液混合成1000 mL备用。

1.5.2 中药浓缩与稀释 将上述1000 mL药液放置于旋蒸仪，将水浴锅温度调控在60 ℃，转速为7～8 r·min^-1，最后浓缩至90 mL；再用蒸馏水将药液稀释至质量分数为4.69 g·mL^-1。

1.6 给药方法 分组后开始灌胃给药，每日1次，连续30 d。各组给药剂量如下：TG组给予7.81 mg·kg^-1雷公藤多苷灌胃，FL组给予31.68 g·kg^-1加减指迷茯苓方灌胃，空白对照组和模型对照组给予等体积的生理盐水灌胃。4组均连续灌胃30 d，每日1次。

1.7 样本制备 大鼠称重，腹腔注射质量分数为10%水合氯醛0.3 mL·（100 g）^-1腹腔麻醉，仰位固定，沿左侧后腿膝关节正中纵行切开皮肤，直至暴露出以膝关节为中心约3 cm×3 cm的区域，沿髌骨上沿0.3～0.4 cm处向下切割直至髌骨，再分别沿髌骨两侧向下分离至胫骨。此时，即打开了膝关节腔，可见由髌骨下极向下延续有一层平滑光亮呈浅淡黄色的滑膜组织。用眼科直镊钝性分离关节囊的滑膜层和纤维层，完整剥离滑膜组织，最后以眼科镊轻轻夹住其中央，用眼科剪完整剪下，置于液氮冷冻PCR备用。同时，将右后肢缘后肢正中纵行切开皮肤直至暴露膝关节，分离剥除肌肉，可见关节囊，在膝关节上、下缘各1 cm左右用眼科剪剪断，放入20倍体积的体积分数为10%的中性甲醛溶液固定10 d，再将关节置于10倍标本体积的体积分数为10% EDTA脱钙液脱钙30 d，2 d更换1次，最后进行脱水、包埋備用。

1.8 观察指标及检测方法

1.8.1 关节肿胀度 用自制的大鼠足容积测量仪（排水法）测量大鼠双后肢踝关节以下容积，每隔6 d测量1次。

1.8.2 AI评分 根据AI评分标准，每隔6 d判断1次双后肢关节肿胀程度。

1.8.3 血管翳形成及关节滑膜厚度 将实验大鼠用质量分数为10%水合氯醛按0.3 mL·（100 g）^-1腹腔注射麻醉；使用剃毛器去除左下肢左侧腹部绒毛，将大鼠仰卧位于平板，助手根据彩超医师要求固定体位。在实验大鼠左侧踝关节表面涂耦合剂，使用频率为18 MHz的探头进行纵横切面观察，以能够完整清晰显示关节腔，显示滑膜变化的切面作为最终评估的切面。以此切面对关节血管翳、滑膜厚度进行仔细观察，对相关数据进行测量并储存成像图。检查结束后，由彩超医生对图像进行判读。利用彩超Szkudlarek评分［6］评价治疗后（造模42 d）各组大鼠左侧踝关节的关节积液、多普勒血流及滑膜增生、骨质侵蚀分级。

1.8.4 实时定量反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测滑膜组织中VEGF和FLK-1的mRNA表达

1.8.4.1 mRNA提取 剥离大鼠膝关节滑膜组织每只15 mg左右，加入总RNA抽提试剂（Trizol），放入组织研磨仪研磨；然后，三氯甲烷、苯酚、异丙醇沉淀法抽提总RNA，干燥，溶于12 μL DEPC 水中；待RNA溶解后，-80 ℃保存备用。

1.8.4.2 cDNA合成 采用cDNA逆转试剂盒，并按其说明书进行。

1.8.4.3 qPCR反应 采用TransStart Top Green qPCR SuperMix并按其说明书进行，所用引物见表1。反应条件：95 ℃，预变性30 s，然后进入95 ℃，变性5 s，60 ℃，延伸30 s，进行45个循环；循环结束后，65 ℃延伸30 s，降至4 ℃。

1.9 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以表示，采用单因素方差分析及t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况观察 造模12 d后，与空白对照组比较，模型对照组、TG组及FL组大鼠体质量增长缓慢，之后均有所下降；造模第42天后，与模型对照组和TG组比较，FL组大鼠体质量明显升高，见表2。CIA大鼠踝关节和趾关节病变明显，呈对称性，且后肢最先发病。24只大鼠总发病率为100 %。

造模后第12天可见，部分大鼠关节出现红肿、瘀斑及轻度肿胀；第14天双侧踝趾关节红肿逐渐加重，部分关节表面皮肤发亮充血。之后，模型对照组关节症状继续加重、行动受限，FL组与TG组关节红肿未见加重。治疗20 d后FL组与TG组部分大鼠关节红肿逐渐减轻，而模型对照组关节红肿继续加重。造模第42天，模型对照组部分大鼠可见负重困难、关节活动障碍，FL组与TG组症状减轻。

2.2 各组大鼠治疗前后AI评分比较 治疗前（造模第12天），模型对照组、TG组、FL组大鼠AI评分差异无统计学意义（P > 0.05）；3组与空白对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。治疗后（造模第42天），与模型对照组比较，TG组和FL组大鼠AI评分明显降低（P < 0.05或P < 0.01）。见表3。

2.3 各组大鼠关节彩超Szkudlarek评分比较 治疗后（造模第42天），TG组和FL组组大鼠左侧踝关节的关节积液、多普勒血流及滑膜增生、骨质侵蚀分级与模型对照组比较，差异有统计学意义

（P < 0.01）。见表4。

2.4 各组大鼠关节滑膜组织中VEGF、FLK-1 mRNA表达水平比较 以GAPDH为内参，利用实时定量RT-PCR分别检测各组大鼠滑膜组织中VEGF mRNA和FLK-1 mRNA的表达，结果显示，与空白对照组比较，模型对照组表达水平显著升高（P < 0.01）；与模型对照组比较，FL组、TG组均显著降低（P < 0.01）；与TG组比较，FL组的VEGF mRNA水平较高（P < 0.01），而FLK-1 mRNA水平显著降低（P < 0.01）。见表5。

3 讨 论

指迷茯苓丸又称茯苓丸，出自宋·王贶《全生

指迷方》，原方由姜制半夏二两、茯苓一两、枳壳五钱、风化硝二钱半及姜汁组成。原书谓：前药共为细末，姜汁糊丸，如梧桐子大，每服30丸，食后姜汤送下。清·程国彭在《医学心悟》中说：“肩背痛，古人主以茯苓丸，谓痰饮为患也，痰饮随风走入经络而肩背肿痛，治无不效。”谢观在《中国医学大辞典》茯苓丸条目第2项中，详细叙述了其功用、药物组成、制法、用法等，指出：“治中脘留伏痰饮，脾气虚弱，痰邪相搏以致手臂牵掣，或战掉不能举物，筋脉挛急而痛，或四肢不能移转。”笔者所用加减茯苓方组方为胆南星、茯苓、枳壳、风化硝、生姜（质量比为8∶4∶2∶1∶4），水煎服。因天南星“治痰功同半夏”，然半夏虽属辛散，但专理脾胃湿痰，而天南星辛散之力胜过半夏，专主经络风痰。胆南星为天南星经过牛胆汁制，燥性已减，性味苦凉，兼清痰热，对于痰浊久滞郁而化热更为妥当，为君药。茯苓味淡性平，“祛邪而不伤正，补而不助邪”，有化痰渗湿、健脾宁心之效，助胆南星化痰；枳壳味苦辛酸性微寒，具有宣化气机、行气化痰之功，与茯苓共为臣药。生姜味辛性温，具有解表散寒、温中止呕、化痰止咳、行水解毒之效，可佐助胆南星化痰浊，又制胆南星、芒硝之毒，而为佐药。芒硝味辛苦咸性寒，有泻下、清热、润燥、软坚的作用，可引痰浊之邪从大便排出，又引经报使，而为使药。5味药联用，祛邪而不伤正，共奏化痰泄浊之功。

本研究中，笔者以雷公藤多苷［7］为阳性对照组，利用动物整体形态变化、受累关节彩超、关节滑膜分子生物学手段，观察了加减指迷茯苓方对CIA大鼠的治疗作用。结果显示，加减指迷茯苓方和雷公藤多苷均可使大鼠关节炎症显著下降，同时可使滑膜组织中VEGF mRNA、FLK-1 mRNA 水平显著降低。表明加减指迷茯苓方可通过抑制滑膜组织中VEGF及其受体的表达，抑制滑膜增生、延缓骨质侵蚀，进而使得CIA大鼠AI指数降低，有效控制CIA大鼠关节炎症。本实验也说明中医化痰法对RA具有较好的治療前景。

（致谢：厦门市中医院B超功能科刘晔医师协助完成关节彩超评价。）

参考文献

［1］ JIN S，LI M，FANG Y，et al.Chinese Registry of rheumatoid arthritis（CREDIT）：Ⅱ.prevalence and risk factors of major comorbidities in Chinese patients with rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Res Ther，2017，19（1）：251-258.

［2］ BURMESTER GR，POPE JE.Novel treatment strategies in rheumatoid arthritis［J］.Lancet，2017，389（10086）：2338-2348.

［3］ WU S，LI Y，LI Y，et al.Interleukin-35 attenuates collagen-induced arthritis through suppression of vascular endothelial growth factor and its receptors［J］．Int Immunopharm，2016，34（1）：71-77.

［4］ KENDREW J，EBERLEIN C，HEDBERG B，et al.An antibody targeted to VEGFR-2 Ig domains 4-7 inhibits VEGFR-2 activation and VEGFR-2-dependent angiogenesis without affecting ligand binding［J］.Mol Cancer Ther，2011，10（5）：770-783.

［5］ 王承德，沈丕安，胡蔭奇.实用中医风湿病学［M］.2版.北京：人民卫生出版社，2015：16-21.

［6］ 中国医师协会超声医师分会.中国肌骨超声检查指南［M］.北京：人民卫生出版社，2017：164-167.

［7］ 韩曼丽，章金春.雷公藤多苷对胶原诱导性关节炎大鼠组织中血管内皮生长因子及血管内皮生长因子受体2 mRNA表达水平的影响［J］.医学研究生学报，2013，26（5）：478-480.