巴戟天水提物与巴戟天多糖促进C2C12肌管分化作用机制

潘瑞金 姜谧 金丽英 黄涛

(1吉林大学第一医院心脏外科，吉林 长春 132000；2沈阳医学院病理学教研室)

骨骼肌在血糖利用方面作用极其重要，人体约70%的糖原储存由骨骼肌完成，85%以上的糖分是供给骨骼肌转化成能量和体力的〔1〕。同时人体所有的活动几乎都是由骨骼肌收缩来完成的，其强弱直接影响人体的行动能力。因此，临床上糖尿病、肌少症、肥胖等疾病都与骨骼肌功能缺陷有关，特别是与年龄、疾病相关的肌肉损伤或损失有关〔2〕。巴戟天(Morindae Radix，Morinda officinalis How.)为双子叶植物药茜草科植物巴戟天的根〔3〕。《本经》有载巴戟天主大风邪气，阴痿不起，强筋骨，安五脏，补中增志益气。巴戟天主要含有蒽醌类、环烯醚萜类、糖类及黄酮类等成分〔4〕。其中巴戟天多糖(MP)具有抗氧化、抗疲劳、免疫调节、抗骨质酥松等药理作用〔5〕。本研究将巴戟天水提物(MA)和MP作用于小鼠骨骼肌细胞C2C12肌管，旨在探讨MA及MP调节骨骼肌分化的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器 紫外分光光度计(WD-9403F)，Bio-Rad成像系统(GelDoc XR+IMAGELAB)，Glomax multi检测系统(E8944)，莱卡荧光显微镜(DM2500)。

1.1.2试药 巴戟天购自长春中药大学附属医院，C2C12细胞购自American Type Culture Collection (ATCC)，胎牛血清(FBS)，马血清(HS)及DMEM购于GIBCO公司，MP、D-葡萄糖购自成都普菲德生物技术有限公司，肌球蛋白重链(MyHC)、成肌分化抗原(MyoD)、肌细胞生成素(Myogennin)抗体购自Santa Cruz 生物技术有限公司，线粒体转录因子(TFAM)抗体购自Cell Signaling生物技术有限公司。细胞葡萄糖摄取测试剂盒购自Cayman Chemical公司。细胞线粒体提取试剂盒购自Thermo Fisher 科技公司。

1.2方法

1.2.1MA制备 称取实验所需的20 g巴戟天，加入500 ml蒸馏水并浸泡30 min，大火加热煮沸小火微沸提取两次每次1.5 h，真空抽滤，合并两次滤液，浓缩直至膏状，冷冻干燥48 h，在研磨至粉状，4℃冷藏备用。

1.2.2MA中多糖的含量测定 本实验采用硫酸苯酚法，精确称取MA粉末10 ml，溶解并定容至100 ml容量瓶中。1 ml供试液与1 ml 5%苯酚溶液混匀后加入5 ml浓硫酸，反应5 min，水浴加热15 min，冷却30 min后，紫外分光光度法，490 nm波长下读取吸光度。并对仪器精密度、实验重复性及样品溶液的稳定性进行方法学考察，D-葡萄糖为标准品制备标准曲线。计算MA中多糖的含量。

1.2.3细胞的培养及分化 C2C12细胞采用含有10%FBS的DMEM，37℃，5% CO2培养箱中培养，细胞生长至 80%左右，用含有2% HS的DMEM培养基诱导肌管分化，每天更换培养基，连续诱导5 d至肌管形成后，不同浓度的MA和MP及阳性药二甲双胍给药24 h，细胞收获后备用。将细胞分成6组，N组正常培养，MA0.5组为MA 0.5 mg/ml给药组，MA1.0为MA 1.0 mg/ml给药组，MP1.0组为MP 1.0 mg/ml给药组，MP2.0组为MP 2.0 mg/ml给药组，M组为二甲双胍给药组。

1.2.4细胞活性检测 将C2C12细胞接种于96孔板中(103个/孔)，用不同浓度的MA和MP及阳性药二甲双胍给药24 h后，移除培养基，按EZ-cytox细胞活性试剂盒方法，测量OD值，计算细胞活性。

1.2.5Western印迹 C2C12 肌管给药24 h后，细胞收获，RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA 法检测蛋白浓度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离凝胶，80 V电泳分离蛋白，4℃ 120 V转聚偏氟乙烯(PVDF)膜2 h。5%脱脂奶粉室温封闭3 h。分别一抗、二抗孵育后，于Bio-Rad成像系统下加电化学发光(ECL)显影液显影，以β-actin为内参，计算相关蛋白表达水平。

1.2.6C2C12肌管糖摄取量检测 C2C12肌管给药24 h后，采用细胞葡萄糖摄取检测试剂盒方法饥饿培养6 h后，培养基中加入荧光葡萄糖类似物(2-NBDG)100 μl继续培养4 h后，485/650 nm(激发光/发射光)滤镜下荧光检测C2C12肌管2-NBDG的摄取量。

1.2.7C2C12肌管线粒体提取 C2C12肌管给药24 h后，采用细胞线粒体提取试剂盒方法，收获的细胞1×磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，加入800 μl试剂A，中速涡旋裂解5 s，加入10 μl试剂B，以高速度涡旋5 s，冰上冷却5 min，期间每分钟涡旋1次，5 s/次，加入800 μl混合有1%的蛋白酶抑制剂的试剂C，混合均匀，4℃，750 r/min离心10 min，取上清14 000 r/min离心15 min，再将沉淀加入500 μl试剂C，4℃，14 000 r/min离心5 min，管内沉淀即为线粒体。线粒体蛋白提取后，BAC法测定线粒体蛋白含量。

1.2.8C2C12免疫荧光染色 将C2C12接种于Thermanox塑料盖片上并诱导肌管分化，C2C12肌管给药24 h后，用4%多聚甲醛固定10 min，0.1% Triton X-100孵育20 min，1×PBS冲洗后，用5%牛血清白蛋白(BSA)室温孵育30 min，MyHC抗体4℃孵育过夜。随后用荧光染料AlexaFluor 488室温孵育1 h，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色5 min。最后，200倍镜下荧光显微镜观察MyHC的表达。

1.3统计学分析 使用ImageJ软件对图像进行分析，并用GraphPad分析软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1MA中MP的含量测定 以D-葡萄糖标准溶液制备标准曲线(图1)，所得线性方程为y=10.175x+0.005，R=0.999 6，实验结果表明在0.02～0.10 mg/ml浓度范围内，线性关系良好。平行制备MA溶液6份，测定MA溶液中多糖平均含量为5.23%，RSD值为1.56%，本实验重复性良好。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2MA与MP对C2C12细胞活性的影响 MA 0.00、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 mg/ml处理C2C12细胞活性分别为(99.89±1.67)%、(103.91±2.32)%、(107.58±2.21)%、(113.74±3.43)%、(117.45±2.27)%、(90.80±2.14)%；MP 0.00、0.01、0.05、0.10、0.20、0.40处理C2C12细胞活性分别为：(100.11±1.48)%、(103.25±2.95)%、(107.57±2.78)%、(112.18±3.65)%、(117.29±1.01)%、(87.02±4.46)%。0.10、0.50、1.00 mg/ml的MA可以显著增强C2C12细胞活性(P<0.05)；2.0 mg/ml的MA可以显著抑制C2C12细胞活性(P<0.05)。0.05、0.10、0.20 mg/ml 的MP可以显著增强C2C12细胞活性(P<0.05)；0.40 mg/ml的MA可以显著抑制C2C12细胞活性(P<0.05)。通过C2C12细胞活性测试结果，本实验选择0.50、1.00 mg/ml为后续实验MA给药浓度，0.10、0.20 mg/ml为MP后续实验给药浓度。

2.3MA与MP对C2C12肌管糖摄取的调节作用 MA 1.0组、MP 2.0组、M组C2C12肌管的葡萄糖摄取能力及GLUT4蛋白表达与N组相比存在显著性差异(P>0.05)。见表1、图2。

表1 各组肌管葡萄糖摄取能力及GLUT4、MyHC、MyoD、Myogenin蛋白表达比较

图2 各组GLUT4、MyHC、MyoD、Myogenin蛋白表达比较

2.4MA与MP对C2C12肌管分化的调节作用 MA1.0组、MP1.0组、MP2.0组C2C12肌管中MyHC蛋白表达水平与N组相比存在显著差异(P>0.05)。见表1。同时对C2C12肌管中MyHC的表达进行荧光染色，结果如图3所示，MA与MP能够有效增加肌管分化长度和MyHC表达的荧光亮度。MA1.0组、MP2.0组的C2C12肌管中MyoD、Myogenin蛋白表达水平与N组相比存在显著差异(P>0.05)。见表1。

图3 C2C12肌管MyHC蛋白免疫荧光染色(×200)

2.5MQ与MP对C2C12肌管线粒体功能的调节作用 与N组相比，其余各组C2C12肌管线粒体蛋白含量显著增加，MA1.0组与MP2.0组中C2C12肌管线粒体蛋白的TFAM表达水平较N组差异显著(均P<0.05)。见表1、图4。

图4 TFAM蛋白表达

3 讨 论

巴戟天为补肾要剂，能治五劳七伤，强阴益精。气味辛温，又能祛风除湿，故可用于腰膝疼痛，风气脚气水肿等症。《千金要方》中将巴戟天配伍淮牛膝，主要以巴戟天补肾壮阳、强筋骨，以淮牛膝补肝肾、强筋骨，以酒助药力。用于肝肾不足，肾阳虚衰，阳痿，腰膝酸软，下肢无力。多糖是中药中广泛存在的成分，有研究证明巴戟天能够降低高血糖小鼠的血糖并提高高血糖小鼠的抗氧化能力〔6〕。研究表明，MP能促进成骨细胞的分化，促进细胞增殖，具有抗骨质疏松的作用〔7〕。

肌管是一种高度代谢活性的细胞类型，线粒体生物发生可以响应代谢转移，如肌管的发生和分化所需能量的增加及肌管中的糖代谢能力增强〔8〕。线粒体生物发生是由一系列转录因子调控的，TFAM就是研究线粒体发生调控机制的重要靶点之一。TFAM通过与线粒体DNA (mtDNA) 轻链和重链的启动子区域特异性的结合，从而激活mtDNA的转录〔9〕。本实验结果证明，1.0 mg/ml MA与0.2 mg/ml MP可以通过调节TFAM蛋白表达有效提高线粒体生物发生。线粒体生物发生为C2C12肌管的分化提供能量，成肌细胞向肌管分化是由成肌调节因子MRFs家族调控的，如MyoD、MRF4、Myf5和Myogenin〔10〕。MyHC是肌原纤维粗丝的骨架成分之一。Lin等〔11〕以MyoD、Myogenin及MyHC表达水平来评价C2C12肌管分化状态。本研究结果证明，1.0 mg/ml MA与0.2 mg/ml MP可以通过调节MyoD、Myogenin及MyHC的表达加强C2C12肌管分化水平。葡萄糖的利用能力是骨骼肌功能的重要评价。GLUT4 是细胞膜上的一种葡萄糖转运载体，与葡萄糖摄取能力呈正相关。研究表明GLUT4基因表达障碍可以引起糖耐量减退和胰岛素抵抗〔12〕。本研究结果表明，1.0 mg/ml MA与0.2 mg/ml MP可以通过调节GLUT4蛋白表达有效增强C2C12肌管葡萄糖摄取能力。

综上，巴戟天和MP可通过调节线粒体生物发生促进C2C12 肌管分化及葡萄糖摄取。因此巴戟天及MP可能会通过改善骨骼肌功能缺陷应用于糖尿病、肌少症、肥胖等疾病，本研究将为巴戟天及MP的临床应用提供理论基础及科研依据。