丹酚酸B减轻骨关节炎模型大鼠软骨组织损伤

骞立刚，孙 博，于 泊，陈 康，马 铮，陈涛平，王云飞

河北大学附属医院 骨科，河北 保定 071000

骨关节炎(osteoarthritis)是中老年人发病率较高的慢性疾病，可引发患者骨关节炎性反应，严重时导致关节软骨坏死，影响患者正常行动[1]。低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)可促进低氧适应性基因的高表达，加剧炎性反应，诱导血管生成[2]。HIF-1可促进下游血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的高表达，VEGF是骨关节炎发病程度的重要标识之一[3]。

丹酚酸B(salvianolic acid B)主要存在于丹参中，已证实具有抗感染、消菌、抗病毒等功效，在治疗关节炎疾病中发挥重要作用[4]。丹酚酸B可促进成骨分化，缓解骨质疏松引起的关节炎[5]。推测其对于切断交叉韧带法(anterior cruciate ligment transection，ACLT)诱导产生的骨关节炎也具有治疗作用。本研究构建骨关节炎大鼠模型，首次探讨丹酚酸B是否通过调控HIF-1/VEGF信号通路对骨关节炎模型大鼠的软骨组织损伤产生影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及动物

SPF级雄性SD大鼠72只，7周龄，体质量(260±15) g[万泰沧海(厦门)生物技术有限公司，许可证号SCXK(闽)2018-0002]。

尼美舒利(海南康芝药业股份有限公司)；丹酚酸B(源叶生物科技有限公司)；HIF-1激活剂1,4-DPCA(圣克鲁斯生物技术公司)；大鼠白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)检测试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)；大鼠血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)检测试剂盒(子科生物ZIKER公司);大鼠一氧化氮合成酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)检测试剂盒(上海韵泰信息科技有限公司);番红固绿染色试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司);Masson染色试剂盒(上海尚宝生物科技有限公司);GAPDH抗体、HIF-1抗体、VEGF抗体、基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13，MMP-13)抗体和活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)抗体(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：将大鼠分为假手术组、骨关节炎组、尼美舒利组、丹酚酸B高(40 mg/kg)和丹酚酸B低剂量组(10 mg/kg)及丹酚酸B+HIF-1激活组(丹酚酸B 40 mg/kg和HIF-1激活剂1,4-DPCA 2 mg/kg)，每组12只。采用ACLT法构建骨关节炎大鼠模型[6]。采取腹腔注射给药，每天1次，连续给予20 d。

1.2.2 血清炎性相关因子水平的检测：末次注射24 h后，麻醉各组大鼠，随后立即处死，暴露腹主动脉，抽取2.5 mL血液，4 ℃ 6 000 r/min离心5 min，取上层血浆，按照试剂盒说明书方法检测IL-6、TNF-α和iNOS含量。

1.2.3 显微CT机骨质量分析：各组大鼠腹主动脉取血后，切开表面皮肤，剥离表面组织，取出大鼠踝骨，剥离关节处软骨组织，部分软骨组织置于4%多聚甲醛中固定，部分液氮处理，研磨成粉末后，冻存备用。清除大鼠踝骨表面附着的组织，反复清洗，确保骨表面无其他附着物。置于4%多聚甲醛中固定12 h，通过显微CT机对骨表面进行扫描，电流40 μA，控制电压90 kV，扫描厚度约为10 μm，扫描角度360°，帧数为1。对扫描图像进行三维重构和骨质量分析，测定骨体积分数(BV/TV)、踝骨表面积与骨体积比值(BSA/BV)。

1.2.4 染色观察软骨组织病理学变化：取出固定好的软骨组织，加入EDTA脱钙处理，不同浓度乙醇梯度脱水，石蜡包埋，制作石蜡切片，切片厚度5 μm，切片脱蜡至水，按照试剂盒说明书方法进行番红固绿染色。

Masson染色：铁苏木精染色5 min，清水反复冲洗，盐酸分化后冲洗直至返蓝，品红染色3 min，冰醋酸冲洗20 s，1%磷钼酸水溶液处理2 min，苯胺蓝染色3 min，冰醋酸冲洗20 s，不同浓度乙醇梯度脱水，树脂封片后上镜观察染色结果。

1.2.5 Western blot检测软骨组织HIF-1、VEGF、MMP-13、cleaved caspase-3蛋白：取出冻存备用的软骨组织粉末，加入1 mL裂解液，充分混匀振荡裂解蛋白质，加入蛋白质提取液提取蛋白质，与上样缓冲液混合后，加热变性加入凝胶孔道中，电泳后转膜，脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗(GAPDH抗体、HIF-1抗体、VEGF抗体、MMP-13抗体及cleaved caspase-3抗体，1∶1 500)，4℃孵育过夜。TBST反复清洗，加入羊抗兔二抗(1∶1 500)，常温孵育35 min，TBST反复清洗，将发光液A液和B液混合后倒于膜上，室温浸泡60 s，取出用滤纸吸干多余水分，置于扫描系统，进行条带分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 丹酚酸B对骨关节炎模型大鼠骨质量的影响

与假手术组相比，骨关节炎组踝骨BV/TV显著降低(P<0.05)，BSA/BV显著升高(P<0.05)；与骨关节炎组相比，尼美舒利组、丹酚酸B高及低剂量组踝骨BV/TV显著升高(P<0.05)，BSA/BV显著降低(P<0.05)；与丹酚酸B高剂量组相比，丹酚酸B低剂量组、丹酚酸B+HIF-1激活组踝骨BV/TV显著降低(P<0.05)，BSA/BV显著升高(P<0.05)(图1)。

*P<0.05 compared with sham; # P<0.05 compared with osteoarthritis; △ P<0.05 compared with salvianolic acid B high dose(40 mg/kg)图1 各组大鼠踝骨BV/TV和BSA/BV水平比较Fig 1 Comparison of BV/TV and BSA/BV levels in the ankle bone of rats in each group

2.2 丹酚酸B对骨关节炎模型大鼠炎性反应的影响

与假手术组相比，骨关节炎组血清IL-6、TNF-α含量和iNOS活性显著升高(P<0.05)；与骨关节炎组相比，尼美舒利组、丹酚酸B高和低剂量组血清IL-6、TNF-α含量及iNOS活性显著降低(P<0.05)；与丹酚酸B高剂量组相比，丹酚酸B低剂量组、丹酚酸B+HIF-1激活组血清IL-6、TNF-α含量及iNOS活性显著升高(P<0.05)(图2)。

2.3 丹酚酸B对骨关节炎模型大鼠软骨病理学变化的影响

假手术组软骨组织表面平整，无明显突起，组织全染至番红色，组织中胶原纤维数量充足，组织间仅有少量缝隙；骨关节炎组软骨组织表面出现多条裂痕，表层细胞数量减少，几乎全部失染，组织中出现大量缝隙，胶原纤维数量急剧减少；尼美舒利组、丹酚酸B高及低剂量组软骨组织表面逐渐恢复平整，失染明显减少，组织间无明显缝隙，胶原纤维逐渐增多；丹酚酸B+HIF-1激活组软骨组织表面仍有裂痕，几乎完全失染，细胞间隙扩大，胶原纤维数量仍然较少(图3)。

*P<0.05 compared with sham; # P<0.05 compared with osteoarthritis; △ P<0.05 compared with salvianolic acid B high dose(40 mg/kg)图2 各组大鼠血清IL-6、TNF-α含量及iNOS活性比较Fig 2 Comparison of IL-6, TNF-α contents and iNOS activity in serum of rats in each group

图3 软骨组织番红固绿染色及Masson染色Fig 3 Safranin O-fast green staining and Masson staining of rat cartilage tissues (×200)

2.4 丹酚酸B对骨关节炎大鼠软骨HIF-1、VEGF、MMP-13及cleaved caspase-3蛋白表达的影响

与假手术组相比，骨关节炎组软骨HIF-1、VEGF、MMP-13、cleaved caspase-3蛋白表达量显著升高(P<0.05)；与骨关节炎组相比，尼美舒利组、丹酚酸B高及低剂量组软骨HIF-1、VEGF、MMP-13、cleaved caspase-3蛋白表达量显著降低(P<0.05)；与丹酚酸B高剂量组相比，丹酚酸B低剂量组及丹酚酸B+HIF-1激活组软骨HIF-1、VEGF、MMP-13及cleaved caspase-3蛋白表达量显著升高(P<0.05)(图4，5)。

A.sham; B.osteoarthritis; C.nimesulide; D.salvian-olic acid B(40 mg/kg); E.salvianolic acid B(10 mg/kg); F.salvianolic acid B+HIF-1 activation图4 软骨组织HIF-1、VEGF、MMP-13及cleavedcaspase-3蛋白表达量Fig 4 Expression levels of HIF-1, VEGF, MMP-13, and cleaved caspase-3 in cartilage tissues

3 讨论

骨关节炎的发病机理复杂但最终都会引发炎性反应，伴随疼痛反应的同时对骨质量产生影响，严重影响中老人正常生活[7-8]。本研究发现，模型大鼠踝骨BV/TV降低，BSA/BV升高，这是骨关节变形和骨基质损伤的重要标志；同时大鼠血清IL-6、TNF-α含量及iNOS活性显著升高，表明炎性反应加剧，与骨关节炎病征一致，证明模型构建成功。

丹酚酸B可通过调控凋亡，抑制炎性反应，从而减轻心血管疾病危害[9]。以丹酚酸B为主要成分的治疗性药物复方丹参注射液可显著减轻炎性因子的表达水平[10]。本研究发现丹酚酸B可通过调控炎性反应，缓解骨变形，改善骨基质损伤，从而减轻骨关节炎病情。进一步观察发现，丹酚酸B可以通过缓解软骨组织损伤，促进胶原合成，加速组织恢复，从而改善病情。但具体的作用机理有待进一步探索。

有文献指出，MMP-13可特异性调控软骨裂解，加速软骨组织细胞凋亡，从而破坏软骨组织正常发挥功能[11]。MMP-13在关节炎患者的软骨组织中特异性地高表达，破坏软骨组织，进一步加剧关节炎，其高表达受多种炎性因子表达量的影响，共同参与调控骨关节炎[12]。本研究发现，丹酚酸B可通过抑制MMP-13的表达，缓解软骨组织损伤，减缓细胞凋亡。同时有文献指出，HIF-1和VEGF在关节炎患者软骨组织高表达，HIF-1和VEGF的高表达可进一步加剧类风湿关节炎病情，以丹酚酸B为主要成分的丹参可通过抑制HIF-1和VEGF的表达，对脑缺血再灌注损伤等多种疾病产生影响[13]。本研究发现，丹酚酸B很可能通过调控HIF-1、VEGF发挥作用。本实验在丹酚酸B作用的同时激活HIF-1蛋白表达，发现大鼠HIF-1、VEGF蛋白表达升高，同时软骨组织损伤和炎性反应加重，进一步验证相关推测。

*P<0.05 compared with sham group; # P<0.05 compared with osteoarthritis group; △ P<0.05 compared with salvianolic acid B(40 mg/kg) high dose

Fig 5 Comparison of HIF-1, VEGF, MMP-13 and cleaved caspase-3 protein expression levelsin cartilage tissues of rats in each group

综上所述，丹酚酸B可通过调控HIF-1/VEGF通路，抑制HIF-1、VEGF表达，进而抑制MMP-13、cleaved caspase-3蛋白表达，减轻细胞凋亡和炎性反应，缓解软骨组织损伤，加速胶原生成，从而缓解骨关节炎。丹酚酸B药效广泛，是否还通过其他作用途径参与调控骨关节炎，还有待进一步实验加以说明。