黄芩提取物抑制IL-22诱导的人角质形成细胞系HaCaT过度增殖

曾 颖，付桂莉

华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院 皮肤科， 湖北 武汉 430019

银屑病是临床皮肤科常见的炎性疾病，且还可能伴有类风湿性关节炎导致关节出现损害，可能会累及全身，这对患者身体健康和心理健康造成严重的困扰[1]。银屑病发病过程与细胞免疫应答过程有关，其中，角质形成细胞的过度增殖为显著病理特征。IL-22是活化的T细胞产生的一种效应因子，可加快角质形成细胞分化和增殖，与银屑病发展有关[2]。黄芩(Scutellaria Baicalensis Georgi)是唇形科植物黄芩的干燥根，有清热燥湿、泻火解毒、止血等功效，化学成分较为丰富，受到国内大多学者的关注，在抗肿瘤、抗菌、调节免疫等均有涉猎[3]。之前的研究结果显示，黄芩提取物对牙周炎具有改善作用，也能抑制神经炎性反应[4-5]，但在银屑病中的研究尚不清楚。微小RNA(microRNA,miRNA)是小分子非编码RNA，不具备蛋白质编码能力的，已被证明与银屑病发展密切相关[6]，如银屑病患者血清和皮肤组织中miR-369-3p表达上调，与皮损严重程度呈正相关[7]。鉴于此，本研究用IL-22诱导人永生化角质形成细胞系HaCaT建立银屑病细胞模型[8]，探讨黄芩提取物(Scutellaria extract)通过调控miR-369-3p，对IL-22诱导的人永生化角质形成细胞系HaCaT增殖、凋亡和炎性反应的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 黄芩提取物的制备[4]：黄芩根购自武汉市某草药种植场。称取干燥的黄芩根粉碎成粉末状，取药材加入95%乙醇溶液浸泡2 h，加热回流进行提取2次，过滤后压缩蒸馏回收乙醇溶液，然后在分液漏斗内加入石油醚进行萃取，萃取所得溶液蒸发得到浸膏，即为黄芩提取物(Scutellaria extract，主要成分是黄芩苷类)，采用黄芩苷标准品及液相色谱法检测，黄芩提取物中黄芩苷纯度为98%，可用于后续实验。黄芩提取物溶于PBS溶液中，使用NaHCO3调pH至7.4，完全溶解后调整为1 mg/mL储备，过滤后使用二甲基亚砜进行稀释至实验所需浓度。实验开始前经过查阅文献[4]，并做相关预实验，最后选择黄芩提取物低、中、高剂量(50、100、150 μg/mL)进行实验。

1.1.2 细胞和主要试剂：人永生化角质形成细胞系HaCaT(中科院细胞库)；胎牛血清(杭州四季青公司)；DMEM培养基(Hyclon公司)；白介素-22(IL-22)(PeproTech公司)；miR-369-3p模拟物(miR-369-3p)及其阴性对照(miR-NC)、miR-369-3p抑制物(anti-miR-369-3p)及其阴性对照(anti-miR-NC)、引物(广州锐博生物公司)；Lipofectamine 2000转染试剂盒(上海研卉生物科技有限公司)；噻唑蓝(MTT)试剂盒、凋亡试剂盒(上海碧云天生物公司)；cleaved caspase-3抗体、β-actin抗体、标记的二抗(北京中杉金桥生物公司)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒、白介素-6(IL-6)试剂盒(上海梵态生物公司)；Trizol试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理：将HaCaT细胞分为对照组；IL-22组：用100 ng/mL的IL-22培养细胞(银屑病细胞模型)；低、中、和高剂量组：在IL-22组的基础上，添加黄芩提取物50、100、150 μg/mL培养细胞；anti-miR-NC组：转染anti-miR-NC后，用100 ng/mL的IL-22培养细胞；anti-miR-369-3p组：转染anti-miR-369-3p后，用100 ng/mL的IL-22培养细胞；miR-NC+高剂量组：转染miR-NC后，用100 ng/mL的IL-22和150 μg/mL黄芩提取物同时培养细胞；miR-369-3p+高剂量组：转染miR-369-3p后，用100 ng/mL的IL-22和150 μg/mL黄芩提取物培养细胞。细胞转染时按照Lipofectamine 2000转染试剂盒进行。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖：培养48 h细胞，加入10 μL MTT试剂(5g/L)，继续培养4 h，加入150 μL二甲基亚砜试剂，轻轻振荡时结晶溶解，用酶标仪检测490 nm细胞吸光度值。细胞存活率(%)=实验组吸光值/对照组吸光度值×100%。

1.2.3 流式细胞测量术检测细胞凋亡：使用PBS冲洗细胞，并加入500 μL磷酸盐缓冲液混匀培养，分别加入annexin V-FITC和PI试剂各5 μL，避光反应30 min，1 h内上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.4 Western blot检测cleaved caspase-3蛋白表达水平：加入蛋白质裂解液提取培养48 h细胞，提取细胞总蛋白质按BCA法对其进行定量，蛋白质变性后进行SDS-PAGE处理，处理的蛋白质样品转膜，封闭2 h，加入一抗cleaved caspase-3(稀释1∶800)、β-actin(稀释1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，次日加入带有标记的二抗(稀释1∶2 500)，加入ECL试剂显色，定影、拍照。以β-actin作为内参基因，用Image J分析蛋白质条带吸光度值。

1.2.5 ELISA检测TNF-α、IL-6含量:各组HaCaT细胞，2 000 r/min离心5 min取上清液，按照TNF-α试剂盒、IL-6试剂盒说明书操作步骤，检测各组细胞中TNF-α、IL-6含量。

1.2.6 RT-qPCR检测miR-369-3p表达水平：利用Trizol试剂盒提取各组HaCaT细胞内总RNA，并检测浓度和纯度，根据反转录试剂盒说明书反转录合成cDNA，以此为模板进行荧光定量PCR扩增反应，采用2-△△Ct公式计算miR-369-3p表达水平。miR-369-3p正向引物：5′-TGACCTAAGGGACTCC CACAA-3′，反向引物：5′-TAGCAATATTGCACAGA AGGC-3′；U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCA CA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCG T-3′。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度黄芩提取物对银屑病细胞模型细胞活性和凋亡的影响

与对照组相比，IL-22组细胞存活率升高，细胞凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表达的差异无统计学意义；与IL-22组相比，低、中和高剂量黄芩提取物组细胞存活率降低，细胞凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表达升高(图1，2)。

2.2 不同浓度黄芩提取物对银屑病细胞模型细胞炎性因子水平的影响

与对照组相比，IL-22组TNF-α、IL-6表达增加；与IL-22组相比，低、中和高剂量黄芩提取物组TNF-α、IL-6表达降低(图3)。

2.3 不同浓度黄芩提取物对银屑病细胞模型细胞中miR-369-3p表达的影响

与对照组相比，IL-22组miR-369-3p表达水平增加；与IL-22组相比，低、中和高剂量黄芩提取物组miR-369-3p表达水平降低(图4)。

2.4 miR-369-3p对银屑病细胞模型细胞活性，凋亡及细胞炎性因子的影响

与anti-miR-NC组相比，anti-miR-369-3p组miR-369-3p表达水平降低，细胞存活率降低，凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表达升高，TNF-α、IL-6表达降低(图5，6)。

2.5 miR-369-3p可以逆转黄芩提取物对银屑病细胞模型细胞活性，凋亡以及炎性水平的影响

与miR-NC+高剂量组相比，miR-369-3p+高剂量组miR-369-3p表达水平升高，细胞存活率升高，凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表达降低，TNF-α、IL-6表达增加(图7，8)。

3 讨论

既往的研究结果显示，皮肤组织局部炎性反应、T细胞异常活化等与银屑病发病有关，IL-22是IL-10家族成员因子，在银屑病患者血清中表达上调，与银屑病发展有关[9]。研究结果显示，IL-22可促进人永生化角质形成细胞系HaCaT过度增殖和炎性反应[10]。本研究结果显示IL-22促进人永生化角质形成细胞系HaCaT过度增殖，并提供细胞炎性反应，提示模型构建成功。

A.flow cytometry to detect cell apoptosis; B.Western blot to detect the expression level of cleaved caspase-3 protein图1 不同浓度黄芩提取物对银屑病细胞模型细胞凋亡和相关蛋白表达的影响

A.statistics of cell proliferation; B.statistics of apoptosis rate; C.statistics of cleaved caspase-3 expression level; *P<0.05 compared with control； # P<0.05 compared with IL-22

*P<0.05 compared with control； # P<0.05 compared with IL-22图4 不同浓度黄芩提取物对银屑病细胞模型细胞中miR-369-3p表达的影响Fig 4 Effects of different concentrations of Scutellaria extract on the expression of miR-369-3p in psoriasis cell models

A.flow cytometry to detect cell apoptosis; B.Western blot to detect the expression level of cleaved caspase-3 protein图5 miR-369-3p对银屑病细胞模型细胞凋亡及相关蛋白表达的影响Fig 5 Effect of miR-369-3p on apoptosis and related protein expression in psoriasis cell models

A.statistics of miR-369-3p; B.statistics of cell viability; C.statistics of apoptosis rate; D.statistics of cleaved caspase-3 expression level; E.statistics of TNF-α and IL-6 expression level; *P<0.05 compared with anti-miR-NC

Fig 6 Effects of miR-369-3p on cell viability, apoptosis and cellular inflammatory factorsin psoriasis cell models

A.flow cytometry to detect cell apoptosis; B.Western blot to detect the expression level of cleaved caspase-3 protein图7 miR-369-3p可以部分回复黄芩提取物对银屑病细胞模型细胞增殖和凋亡的影响

A.statistics of miR-369-3p; B.statistics of cell viability; C.statistics of apoptosis rate; D.statistics of cleaved caspase-3 expression level; E.statistics of TNF-α and IL-6 expression level; *P<0.05 compared with miR-NC+ high dose group; high dose.150 μg/mL

Fig 8 miR-369-3p could partially restore the effects of Scutellaria extract on cell viability, apoptosis and inflammationin psoriasis cell models

随着中国传统医药的发展，用于银屑病治疗前景广阔，中医辨证论认为银屑病与“热、血燥、血瘀”有关，中药黄芩味苦、性寒，具有清热燥湿的功效，对神经保护、消炎、提高免疫等具有明显效果，研究证明黄芩具有抗凋亡、抗感染和抗氧化能力[11-12]。还有研究发现，黄芩提取物对过敏性疾病、皮肤病等具有保护作用，还可提高机体内抗炎能力[13]。本研究使用浓度为50、100、150 μg/mL黄芩提取物处理IL-22诱导的人永生化角质形成细胞系HaCaT，结果显示，黄芩提取物可抑制IL-22诱导的HaCaT细胞过度增殖，提高细胞凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表达，抑制TNF-α、IL-6炎性因子表达，提示黄芩提取物可抑制IL-22诱导的HaCaT细胞过度增殖和炎性反应，并促进细胞凋亡。

最近的研究结果显示，miRNA在银屑病中异常表达，如miR-155、miR-210、miR-20b等[14]。研究结果显示，miR-330在银屑病皮肤组织中表达下调，miR-330通过降低CTNNB1表达抑制IL-22诱导的人永生化角质形成细胞系HaCaT增殖[15]。研究结果显示，miR-223可能通过激活PTEN/Akt通路促进IL-22诱导的人永生化角质形成细胞系HaCaT增殖和抑制细胞凋亡[16]。miR-369-3p在轻中度银屑病患者血清内表达上调，可促进银屑病发病[7]，但是具体的分子机制尚不清楚。本研究结果显示，IL-22诱导的人永生化角质形成细胞系HaCaT中miR-369-3p表达上调，用黄芩提取物处理后miR-369-3p下调，提示黄芩提取物可能调控miR-369-3p表达，影响HaCaT细胞的增殖、凋亡和炎性反应。将miR-369-3p抑制物转染IL-22诱导的人永生化角质形成细胞系HaCaT后，发现细胞存活率降低，凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表达升高、TNF-α、IL-6表达降低，提示抑制miR-369-3p，可抑制IL-22诱导的人永生化角质形成细胞系HaCaT过度增殖和炎性反应，并促进细胞凋亡。进一步实验结果显示，过表达miR-369-3p可以逆转黄芩提取物对银屑病细胞模型细胞增殖、凋亡以及炎性反应的影响，提示黄芩提取物可能通过抑制miR-369-3p表达，抑制IL-22诱导的HaCaT细胞过度增殖和炎性反应，促进凋亡，抑制银屑病的发展。

综上所述，黄芩提取物可抑制IL-22诱导的人永生化角质形成细胞系HaCaT过度增殖和炎性反应，并促进其凋亡，其作用可能通过调控miR-369-3p表达有关。