LncRNA MINCR靶向miR-223抑制LPS诱导的人肺泡上皮细胞系A549损伤和炎性反应

杨广林，任丽娟，陈文静，熊维军

四川护理职业学院附属医院/四川省第三人民医院 呼吸内科，四川 成都 610100

急性肺损伤疾病属于一种急性炎性反应，是由肺内、外各种因素引起的肺损伤，该疾病严重时可发展成为急性呼吸窘迫综合征，致死率高达90%[1]。肺泡上皮细胞损伤属于急性肺损伤的一种，因此研究肺泡上皮细胞损伤的机制显得尤为重要。内毒素在许多研究中被发现可引起肺损伤疾病，其主要成分是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，可引起肺泡上皮细胞凋亡，参与肺损伤的发生[2-3]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是目前研究过程中新发现的一类非编码RNA分子，而lncRNA MINCR作为lncRNA家族中的一员，在许多疾病中异常表达，例如，lncRNA MINCR在原发性肝癌组织中的表达水平显著增加[4]。微小RNA(microRNA，miRNA)与许多疾病的病理生理过程密切相关，尤其是全身炎性反应综合征、急性肺损伤的免疫调节[5]。在全身炎性反应过程中，miRNAs可以对许多炎性因子、转录因子进行调控，进而参与炎性细胞增殖、产生和释放多种炎性因子[6]。miR-223作为miRNAs中的一员，在不同疾病的过程中发挥不同的作用。然而，miR-223在急性肺损伤中的表达和作用机制仍不清楚。生物信息学预测到lncRNA MINCR与miR-223存在结合位点。因此,本研究以肺泡上皮细胞系A549为研究对象，探索lncRNA MINCR靶向调节miR-223对LPS诱导的肺泡上皮细胞损伤和炎性反应的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：人肺泡上皮细胞系A549(中国科学院上海细胞库)。

1.1.2 试剂： LPS[酷尔化学科技(北京)有限公司]；含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM培养基(Giboc公司)；RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；反转录试剂盒(Genecopoeia公司)；白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA试剂盒(酶联生物科技有限公司)；活化的半胱天冬氨酸蛋白酶-3(cleave caspase-3)、B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma 2，Bcl-2)一抗(Abcam公司)；Lipofectamine 2000转染试剂盒(Invitrogen公司)；野生型和突变型MINCR荧光素酶报告基因载体(MINCR WT、MINCR MUT)、Si NC(MINCR阴性对照)和Si MINCR(MINCR干扰载体)、miR-223 NC(miR-223阴性对照)、miR-223模拟物(miR-223 mimics)、miR-223抑制物(miR-223 antagomir)以及MINCR、miR-223、U6、β-actin引物(上海生工生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及转染：将A549细胞使用含10%胎牛血清的DMEM培养基接种，置于培养箱(37 ℃，5% CO2)中培养，待细胞增殖至80%～90%汇合时，进行传代培养。

将A549细胞随机分为对照组和LPS组、LPS+转染组(Si NC组、Si MINCR组、miR-223 NC组、miR-223 mimic组、Si NC+miR-223 NC组、Si NC+miR-223 antagomir组、Si MINCR+miR-223 NC组、Si MINCR+miR-223 antagomir组)，其中LPS组选用对数增殖期细胞采用10 μg/mL LPS[8]进行诱导24 h；Si NC组、Si MINCR组、miR-223 NC组、miR-223 mimic组、Si NC+miR-223 NC组、Si NC+miR-223 antagomir组、Si MINCR+miR-223 NC组、Si MINCR+miR-223 antagomir组待细胞汇合至50%～60%时，使用Lipofectamine 2000转染试剂盒分别转染Si NC、Si MINCR、miR-223 NC、miR-223 mimic、Si NC+miR-223 NC、Si NC+miR-223 antagomir、Si MINCR+miR-223 NC、Si MINCR+miR-223 antagomir至细胞，培养24 h后，再加入10 μg/mL LPS诱导24 h。

1.2.2 生物信息学预测和双荧光素酶报告基因实验验证MINCR和miR-223靶向关系：Starbase数据库预测MINCR、miR-223存在结合位点。取对数增殖期的A549细胞接种于96孔板，常规培养24 h后，将细胞分为MINCR WT+miR-223 NC组、MINCR WT+miR-223 mimics组、MINCR MUT+miR-223 NC组、MINCR MUT+miR-223 mimics组，每组设6个重复。按照转染试剂盒说明书进行细胞共转染，转染48 h后，收集上清液检测荧光素酶活性。

1.2.3 RT-qPCR检测细胞中MINCR、miR-223表达水平：选取各组细胞，用RNA抽提试剂盒提取总RNA，按照反转录试剂盒进行反转录得到cDNA。以cDNA为模板进行用RT-qPCR反应。反应体系、条件参照RT-qPCR试剂盒说明书。分别以U6、β-actin为内参，采用2-△△Ct计算MINCR、miR-223相对表达水平。引物序列见表1。

1.2.4 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率:收集各组细胞，悬浮细胞后，加入5 μL annexin V-FITC与碘化丙啶，室温避光孵育15 min；流式细胞仪检测各组细胞情况，计算细胞凋亡率。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primers of RT-qPCR

1.2.5 ELISA检测炎性因子:收集各组细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测上清液中IL-6、TNF-α水平。

1.2.6 Western blot检测各组细胞中cleaved caspase-3、Bcl-2的表达水平:收集各组细胞，加入裂解液，BAC法测定总蛋白质浓度。SDS-PAGE分离，转至PVDE膜，牛奶封闭，依次加入稀释后cleaved caspase-3、Bcl-2、β-actin一抗，4 ℃恒温箱过夜；加入活化辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温孵育2 h，用ECL显色试剂盒显色、拍照，用Image分析灰度值，得出目的蛋白质表达水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 LPS诱导的A549细胞中MINCR、miR-223表达水平

与对照组相比，LPS组MINCR显著增加(P<0.05)，而miR-223表达水平显著降低(P<0.05)(表2)。

表2 LPS诱导的A549细胞中MINCR、miR-223表达水平比较

2.2 MINCR与miR-223靶向关系的预测与验证

Starbase数据库预测MINCR、miR-223存在结合位点。MINCR WT+miR-223 NC组相比，MINCR WT+miR-223 mimics组荧光素酶活性显著降低(P<0.05)(图1，表3)。

WT.wild-type；MUT.mutant-type图1 Starbase预测MINCR、miR-223结合位点Fig 1 Starbase predicted the binding sites of MINCR and miR-223

表3 荧光素酶报告基因实验检测MINCR、miR-223的靶向关系

2.3 干扰MINCR对A549细胞中MINCR表达、凋亡、炎性因子的影响

与对照组相比，LPS组、Si NC组细胞凋亡率、IL-6、TNF-α含量、MINCR表达显著增加(P<0.05)；与Si NC组相比，Si MINCR组细胞凋亡率、IL-6、TNF-α含量、MINCR表达显著降低(P<0.05)(图2，表4)。

2.4 过表达miR-223对A549细胞中miR-223表达、凋亡、炎性因子的影响

与对照组相比，LPS组、miR-223 NC组细胞凋亡率、IL-6、TNF-α含量显著增加(P<0.05)，miR-223表达显著降低(P<0.05)；与miR-223 NC组相比，miR-223 mimic组细胞凋亡率、IL-6、TNF-α含量显著降低(P<0.05)，miR-223表达显著增加(P<0.05)(图2，表5)。

2.5 干扰MINCR或过表达miR-223对A549细胞中cleaved caspase-3、Bcl-2蛋白表达的影响

与对照组相比，LPS组、Si NC组、miR-223 NC组cleaved caspase-3蛋白表达显著增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)；与LPS组、Si NC组相比，Si MINCR组cleaved caspase-3蛋白表达显著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著增加(P<0.05)；与LPS组、miR-223 NC组相比，miR-223 mimic组cleaved caspase-3蛋白表达显著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著增加(P<0.05)(图3，表6)。

图2 干扰MINCR或过表达miR-223后细胞凋亡检测Fig 2 Apoptosis detection after interference with MINCR or over-expression of miR-223

表4 干扰MINCR对A549细胞中MINCR表达、凋亡、炎性因子的影响

表5 过表达miR-223对A549细胞中miR-223表达、凋亡、炎性因子的影响

A.control; B.LPS group; C.Si NC; D.Si MINCR; E.miR-223 NC; F.miR-223 mimic图3 Western blot检测各组细胞cleaved caspase-3、Bcl-2蛋白表达Fig 3 Western blot showed cleaved caspase-3 and Bcl-2 protein expression in each group

2.6 干扰MINCR和抑制miR-223对A549细胞中凋亡、炎性因子的影响

与Si NC+miR-223 NC组相比，Si NC+miR-223 antagomir组细胞凋亡率、IL-6、TNF-α含量均显著增

加(P<0.05)，Si MINCR+miR-223 NC组细胞凋亡率、IL-6、TNF-α含量均显著降低(P<0.05)；与Si NC+miR-223 antagomir组相比，Si MINCR+miR-223 antagomir组细胞凋亡率、IL-6、TNF-α含量均显著降低(P<0.05)；与Si MINCR+miR-223 NC组相比，Si MINCR+miR-223 antagomir组细胞凋亡率、IL-6、TNF-α含量均显著增加(P<0.05)(图4，表7)。

图4 干扰MINCR和抑制miR-223对细胞凋亡的影响Fig 4 Effects of interference with MINCR and inhibition of miR-223 on cell apoptosis

表7 干扰MINCR和抑制miR-223对A549细胞中凋亡、炎性因子的影响

2.7 干扰MINCR和抑制miR-223对A549细胞中cleaved caspase-3、Bcl-2蛋白表达的影响

与Si NC+miR-223 NC组相比，Si NC+miR-223 antagomir组cleaved caspase-3蛋白表达显著增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)，Si MINCR+miR-223 NC组cleaved caspase-3蛋白表达显著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著增加(P<0.05)；与Si NC+miR-223 antagomir组相比，Si MINCR+miR-223 antagomir组cleaved caspase-3蛋白表达显著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著增加(P<0.05)；与Si MINCR+miR-223 NC组相比，Si MINCR+miR-223 antagomir组cleaved caspase-3蛋白表达显著增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)(图5，表8)。

3 讨论

急性肺损伤属于急性重症疾病，临床上主要病理表现为肺泡上皮细胞损伤、通透性增加、腔内释放

A.Si NC+miR-223 NC; B.Si NC+miR-223 antagomir; C.Si MINCR+miR-223 NC; D.Si MINCR+miR-223 antagomir图5 干扰MINCR和抑制miR-223对cleavedcaspase-3、Bcl-2蛋白表达的影响Fig 5 Effects of interference with MINCR and inhibi- tion of miR-223 on the expression of cleaved caspase-3 and Bcl-2 proteins

表8 干扰MINCR和抑制miR-223对cleavedcaspase-3、Bcl-2蛋白表达的影响

多种炎性因子[8]。目前临床治疗方法主要是辅助通气和药物治疗[9]。了解急性肺损伤的发生发展及其调控机制可为临床上提供靶向药物提供依据。本实验采用LPS诱导肺泡上皮细胞系A549，以建立急性肺损伤体外细胞模型，结果发现MINCR显著增加，提示肺泡上皮细胞损伤可能与MINCR的高表达密切相关。研究表明lncRNAs可以通过调控基因表达，参与急性肺损伤的发生、转移和炎性浸润。研究发现干扰lncRNA MALAT1的表达，可以上调BMI-111，进而降低炎性浸润和细胞凋亡，改善LPS诱导的肺损伤[10]。MINCR作为最新发现的lncRNA，其作用成为目前研究的热点。在LPS诱导急性肺损伤细胞模型中，MINCR的表达水平显著增加，干扰MINCR表达，可以抑制细胞凋亡、增强细胞活力，从而改善肺泡细胞受损[11]。本研究发现干扰MINCR可以减缓炎性浸润以及细胞凋亡，减缓肺泡细胞受损，与之前报道一致。

miR-223作为miRNA家族中的一员，在肺部疾病中表现较为突出。在肺结核大鼠肺组织中，miR-223表达水平降低，影响细胞凋亡[12]。在LPS诱导的A549细胞和急性肺损伤模型小鼠中，下调miR-223表达可导致LPS引起的肺损伤[13]。本研究发现提示过表达miR-223可以抑制炎性反应、细胞凋亡，减少肺细胞损伤，与之前报道相吻合。本研究进一步证实MINCR与miR-223存在靶向关系，推测MINCR可能通过靶向调控miR-223影响A549细胞的损伤。MINCR通过海绵吸附miR-223，激活下游蛋白质表达，降低鼻咽癌细胞的放射敏感性[14]。本研究细胞转染miR-223 antagomir后，可逆转Si MINCR发挥的作用。因此推测MINCR通过靶向上调miR-223表达，抑制炎性反应以及细胞凋亡，减少细胞损伤。

综上所述，MINCR可能通过靶向上调miR-223表达，改善LPS诱导的A549细胞炎性反应，抑制细胞凋亡，减少细胞损伤，为急性肺损伤及其治疗提供新的靶点，但由于MINCR作用靶点较多且急性肺损伤的发病机制较为复杂，仍需要进一步研究。