泛癌中SMYD3的表达与预后及免疫浸润之间的关系

陈浩然，司 甜，姜懿珅，王殿恒，周雅博，吕家迪

中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 免疫学系 医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005

SET和MYD 结构域蛋白 3(SET and MYND domain-containing 3 protein, SMYD3)是一种赖氨酸甲基化转移酶[1]。 研究显示SMYD3在多种肿瘤组织中高表达，包括肝癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌、宫颈癌和膀胱癌等[2]。SMYD3可以通过甲基化H3K4、H4K5和H4K20等调控染色质可及性进而调节基因的转录[3]，同时也具有甲基化非组蛋白的功能[4]，如可溶性血管内皮生长因子受体1 (soluble vascular endothelial growth factor receptor-1,VEGFR1)、人表皮生长因子受体2(erb-b2 receptor tyrosine kinase 2, ERBB2)等。

多个研究表明在乳腺癌和肝癌等肿瘤中，敲除SMYD3具有抑制肿瘤生长和迁移的作用[5-6]，但是目前缺少关于SMYD3的泛癌研究，有关SMYD3对于肿瘤免疫微环境的影响及其潜在机制也知之甚少。实体肿瘤的预后和肿瘤微环境中免疫细胞的浸润具有重要的关系，探究SMYD3的表达和免疫浸润的关系对于阐释其在肿瘤发生发展中的作用具有重要价值。本研究使用多个组学数据库系统性分析了SMYD3在多种癌中的预后价值，并在细胞水平证明了SMYD3的表达降低了肿瘤细胞表面主要组织相容性合体(major histocompatibility complex class Ⅰ,MHC-Ⅰ)的水平。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 泛癌数据收集及分析：33种癌的基因表达矩阵和临床信息来自于TCGA数据库(https://xenabrowser.net)，正常组织的基因表达矩阵来自于TCGA和GTEx数据库(https://www.gtexportal. org)。使用R 4.0.2软件完成了泛癌数据分析。

1.1.2 细胞系：小鼠黑色素瘤细胞系B16(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心);培养基：RPMI1640-10% FBS。

1.1.3 主要试剂：anti-Smyd3抗体(GeneTex，1∶1 000)、APC anti-mouse H-2Kb 抗体(BioLegend)、CRISPR-Cas9载体：PX458(Addgene)。

1.2 实验方法

1.2.1 SMYD3 mRNA水平的泛癌分析：使用R语言包“UCSCXenaShiny”对来自TCGA和GTEx的表达矩阵进行正常组织和肿瘤组织的SMYD3水平比较，基因水平均经过标准化。根据肿瘤分期对样本进行分组，比较不同临床分期间的SMYD3表达水平。

1.2.2 SMYD3 蛋白水平的泛癌分析：从HPA(human protein atlas)数据库获得SMYD3在正常组织中的蛋白表达水平数据，并检索SMYD3在乳腺癌，黑色素瘤，肝癌及其正常组织的免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)染色数据。在UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/analysis-prot.html/)数据库检索SMYD3在正常组织和肿瘤组织的标准化蛋白表达水平。

1.2.3 SMYD3表达与肿瘤预后分析：根据SMYD3表达水平分将肿瘤病人为高表达(high expression)和低表达(low expression)组，并使用R语言包“survival”和“survminer”进行对Kaplan-Meier生存分析。使用“coxph”函数构建SMYD3在各种肿瘤中的COX模型，并计算风险比(Hazard Ratio)。

1.2.4 SMYD3在肿瘤免疫中的价值分析：使用Estimate方法计算不同肿瘤中的基质评分(StromalScore)，免疫评分(ImmuneScore)和ESTIMATE评分(ESTIMATEScore)[7]，并其对应的SMYD3表达水平进行pearson相关性分析。使用Timer数据库(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)分析SMYD3和肿瘤浸润免疫细胞的关系[8]。在Kaplan-Meier Plotter(https://kmplot.com/analysis/)的免疫治疗阵列中选择黑色素瘤患者，并根据SMYD3表达水平分组，分析其和患者生存期的关系。

1.2.5Smyd3敲除及MHC-Ⅰ分子表达的检测：在Benchling网站在线设计用于CRISPR/Cas9的sgRNA，并连接到PX458质粒上，包病毒感染B16细胞，2 d后分选阳性克隆，挑选单克隆，完成Smyd3-SG-B16细胞株的构建。使用IFN-γ (10 ng/mL)处理对照组B16细胞及Smyd3敲除组B16细胞24 h。对处理过的细胞，其中一部分用于收集RNA，并使用RT-qPCR检测抗原呈递基因的表达水平；另一部分细胞，使用anti-H2Kb抗体(1 μL/100 μL)在4 ℃染色30 min后用于流式细胞测量术检测细胞表面MHC-Ⅰ分子的表达。

2 结果

2.1 泛癌中SMYD3 mRNA水平的差异

比较多种癌及正常组织SMYD3的mRNA表达量(图1A)。在25种肿瘤组织中SMYD3的表达显著升高，包括肾上腺皮质癌(ACC)、膀胱移行细胞癌(BLCA)、乳腺侵袭性癌(BRCA)、胆管癌(CHOL)、结肠癌(COAD)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBC)、食管癌(ESCA)、多形性成胶质细胞瘤(GBM)、头颈部鳞状细胞癌(HNSC)、肾透明细胞癌(KIRC)、肾乳头状细胞(KIRP)、脑低级别胶质瘤(LGG)、肝细胞癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC)、卵巢浆液性囊腺癌(OV)、胰腺癌(PAAD)、前列腺腺癌(PRAD)、直肠腺癌(READ)、皮肤黑色素瘤(SKCM)、胃腺癌(STAD)、睾丸生殖细胞瘤(TGCT)、子宫内膜癌(UCEC)和子宫癌肉瘤(UCS)。同时在肾嫌色细胞癌(KICH)和急性髓性白血病(LAML)中低表达。此外，在KIRP、HNSC、THYM、TGCT和KICH中，不同肿瘤分期的SMYD3的表达水平表现出显著的差异(图1B)。在KIRP、TGCT和KICH中，肿瘤分期等级越高，SMYD3的表达水平也越高。

2.2 正常组织和肿瘤组织中SMYD3表达的水平差异

SMYD3在大多数组织中具有较高的表达水平(图2A)。同时与正常组织相比，在乳腺癌、结直肠癌、肾透明细胞癌、子宫癌和肝癌中表现出SMYD3高表达(图2B)。根据HPA数据库中免疫组化染色数据表明在乳腺癌、黑色素瘤和肝癌组织中的SMYD3水平高于正常组织(图2C)。

A.expression of SMYD3 in normal and tumor tissues; B.expression of SMYD3 in different tumor stages; *P< 0.05,

**P<0.01,***P<0.001 compared with normal group

图1 SMYD3在泛癌中的mRNA水平表达
Fig 1 The mRNA expression of SMYD3 in pan-cancer

A.expression level of SMYD3 protein in human normal tissues; B.standardized expression density of SMYD3 in human tumor tissues; C.immunohistochemistry of severe human tumors and corresponding normal tissues

2.3 SMYD3高表达的肿瘤患者预后更差

在12种肿瘤中，SMYD3与患者更差的生存期相关(图3A)，包括ACC(P<0.01)、HNSC(P<0.05)、KICH(P<0.01)、KIRC(P<0.05)、KIRP(P<0.001)、LIHC(P<0.01)、MESO(P<0.01)、SARC(P<0.001)、SKCM(P<0.05)、STAD(P<0.01)、THCA(P<0.001)和UVM(P<0.001)。

SMYD3的表达对于UVM(HR=4.12，P<0.001)、KICH(HR=2.39，P<0.01)、MESO(HR=1.32，P<0.01)、THCA(HR=2.69，P<0.01)、ACC(HR=1.62，P<0.01)、LIHC(HR=1.22，P<0.01)、KIRP(HR=2.07，P<0.05)和STAD(HR=1.26，P<0.05)有着重要的影响(图3B)，并且显示SMYD3对于患者是一项危险因子。

2.4 SMYD3表达水平与肿瘤免疫评分负相关

通过ESTIMATE计算33种肿瘤的StromalScore、ImmuneScore和ESTIMATEScore(图4A)。在33种肿瘤中，SMYD3表达量与StromalScore最相关的3种肿瘤是BRCA(r=0.16)、PRAD(r=-0.24)和KIRC(r=0.27)；与ImmuneScore最相关的3种肿瘤是LUAD(r=-0.25)、THCA(r=-0.29)和SKCM(r=-0.27)；与ESTIMATEScore最相关的3种肿瘤是PRAD(r=-0.22)、THCA(r=-0.24)和SKCM(r=-0.26)。在BRCA、PRAD、KIRC、LUAD、THCA和SKCM中SMYD3表达水平和6种免疫细胞浸润水平的相关性(图4B)，CD8+T细胞和树突状细胞(dendritic cells)浸润数量在5种肿瘤中与SMYD3表达量表现出显著的负相关(P<0.05)。最后对SKCM的免疫治疗队列进行分析，发现SMYD3高表达的患者生存期较差(图4C)。

A.overall survival (OS) of patients with high and low SMYD3 expression; B.forest map of SMYD3 related to overall survival(OS)

2.5 SMYD3抑制B16细胞的MHC-Ⅰ分子表达

SMYD3-SG(敲除组)的B16细胞相对SGCtrl(对照组)的Smyd3表达水平(图5A)，结果显示Smyd3被成功敲除。Smyd3敲除的B16细胞株抗原呈递基因(H2Kb、B2m、Erap1、Tap1、Tap2、Tapbp)的mRNA表达水平升高(图5B)，其细胞表面MHC-Ⅰ的表达水平也高于对照B16细胞(图5C)。

3 讨论

本文通过数据库中大量的患者队列比较了SMYD3在多种肿瘤及癌旁组织的mRNA和蛋白质水平，发现了SMYD3在多种肿瘤组织表达升高的现象，并且发现其高表达水平和多种肿瘤的不良预后相关。考虑到肿瘤免疫微环境对于肿瘤发生发展的重要作用，本研究分析了肿瘤细胞中SMYD3的表达对于免疫细胞浸润的影响，结果显示，SMYD3高表达的患者表现出更低的免疫评分，更少的CD8+T细胞和树突状细胞的浸润。肿瘤免疫浸润减少的重要原因之一是MHC-Ⅰ的表达降低，为了研究SMYD3对MHC-Ⅰ表达水平的影响，本研究建立了稳定敲除Smyd3的B16细胞株，发现Smyd3的敲除可以增加抗原呈递基因的转录水平，并且最终导致MHC-Ⅰ在细胞表面的表达水平上升。

目前，肿瘤免疫治疗已经取得了令人瞩目的成果，但是其仍然面临着很多问题。抗PD-1抗体等免疫检查点阻断剂可以有效阻断肿瘤细胞对于T细胞的抑制作用，但是该疗法仅对部分患者有效，究其原因，免疫检查点阻断(immune checkpoint blockade，ICB)疗法虽然可以改善T细胞的耗竭状态，但是T细胞识别肿瘤细胞这一难题并没有解决[9-10]。肿瘤细胞经常会丢失MHC-Ⅰ分子的表达，在黑色素瘤，乳腺癌，头颈部癌等恶性程度较高的肿瘤中尤其常见[11]。研究表明，ICB疗法和过继性疗法的抵抗与MHC-Ⅰ分子的丢失相关，促进MHC-Ⅰ分子的表达有助于CD8+T细胞浸润肿瘤组织和杀伤肿瘤细胞。本研究的结果表明SMYD3可以下调MHC-Ⅰ分子的表达水平，但是并未探讨这一调控过程的具体机制，可能SMYD3直接表观修饰抗原呈递基因所在的染色质，但也有研究表明SMYD3和JAK/STAT通路关联[12]，STAT家族的多个蛋白已被证明可以调控MHC-Ⅰ的表达。

A.relationship between SMYD3 expression and StromalScore,ImmuneScore,ESTIMATEScore; B.relationship between SMYD3 expression and the number of 6 kinds of immune cells; C.relationship between SMYD3 and prognosis in melanoma immunotherapy cohort; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

A.SMYD3 expression in SGCTRL and Smyd3-SG B16 cells; B.mRNA level of antigen-present genes in SGCtrl and Smyd3-SG B16 cells; C.MHC-Ⅰ density on membrane of SGCtrl and Smyd3-SG B16 cells; Iso.isotype; MFI.mean fluorescence intensity; *P<0.01, **P<0.001 compared with SGCtrl

综上，本研究系统性的分析了SMYD3在泛癌中的作用，使用了广泛的数据库数据，并且结合实验验证，发现SMYD3通过抑制肿瘤微环境中免疫细胞的浸润导致了多种肿瘤的不良预后，且实验结果表明在B16细胞中敲除Smyd3诱导抗原递呈基因上调表达。该研究为以SMYD3为靶点的相关药物研发及临床应用提供了理论依据。