小鼠内源性逆转录病毒Gag抗原在胰岛的表达及单克隆抗体的制备

李 瑜，张 雯，，袁 昱，李姝亭，，王 哲，贲亚琍，*，戴 飏，3*

1.江汉大学 免疫疾病研究所， 湖北 武汉 430056; 2.江汉大学 医学院，湖北 武汉 430056; 3.美国南加州生物医学研究所，加利福尼亚州 圣地亚哥 92056

1型糖尿病(type 1 diabetes，T1D)是一类由T细胞介导，以β细胞破坏导致的胰岛素绝对不足的一种自身免疫性疾病[1-2]。T1D在全球的发病率有逐年递增的发展态势[3]，探究T1D的发病原因不仅有利于T1D的早期诊断，更为了便于建立更高效安全的预防策略与治疗方式。

ERV(endogenous retroviruses，ERV)是几百万年前动物祖先的逆转录病毒感染种系后整合到基因组内的残余物[4]。ERV序列在人类和小鼠基因组序列内占5%～8%[5-6]。Gag基因可调节细胞的跨膜转运和促进病毒的出芽。在30多年前就指出，逆转录病毒元件可能作为特殊抗原致敏免疫细胞，从而引发自身免疫反应[7]。但目前对于触发T1D初始自身免疫性反应的触发器尚不明确[8]。有资料指出，在宿主发育过程中，ERV可能在组织或器官的功能发展(包括免疫激活与耐受)中扮演了重要的角色[9]。

ERV Gag基因编码的病毒核心蛋白能刺激非肥胖糖尿病(non-obese diabetic，NOD)模型小鼠的自身反应性T细胞产生特异性反应[10]。通过制备相关单克隆抗体来检测NOD模型小鼠胰腺中组特异性抗原(group specific antigen,Gag)的表达情况，从而找寻该抗原的表达与T1D发病的相关性。希望为T1D的预防、早期诊断或治疗方式提供一种新的技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级雌性6～8周龄BLAB/c小鼠，体质量16～18 g[合格证号为SCXK(鄂)2015-0018，湖北疾控中心]；SPF级3～6周龄NOD模型小鼠体质量14～18 g(从美国Jackson实验室购买并在江汉大学动物中心繁殖)；小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(Proteintech Group公司)；小鼠胰岛β细胞株(min6)、人胚胎肾细胞系(HEK 293T)(由江汉大学医学院免疫疾病研究所保存)；Gag 194重组蛋白(由AtaGenix公司合成)；Gag 194多肽和Gag QR多肽(由Shanghai GL Peptide 公司合成)；单克隆抗体生物素化(由Proteinab公司合成)；Gag QR质粒、Gag 194质粒、R187单克隆抗体(美国南加州生物医学研究所戴飏教授提供)。

1.2 方法

1.2.1 ERV Gag 194抗原表位的预测: 利用免疫表位数据库在线预测ERV Gag 194 B细胞抗原表位。同时对ERV Gag 194空间结构、氨基酸序列和性质以及抗原性等进行分析，找到合适的多肽位点为下一步制备单克隆抗体做好准备。

1.2.2 ERV Gag单克隆抗体的制备： 1)小鼠的免疫: BALB/c小鼠共进行4次抗原免疫注射，每次注射100 μg偶联抗原肽，首次注射完成后，第28和49天分别进行一次加强免疫，在第59天时取血测试免疫效果并在首次免疫完成后的第70天时进行第3次加强免疫。 2)血清效价的检测: 使用KLH以及KLH偶联抗原肽检测血清效价，每孔100 ng抗原包被96孔板，4 ℃ 过夜。次日每孔加入待测小鼠血清(血清从1 000开始往后2倍稀释使用，直到512 000倍)，37 ℃ 2 h。洗板，加入抗小鼠二抗，37 ℃孵育1 h，洗板，加入显色剂，室温避光15 min后，加入ELISA终止液。酶标仪450 nm读取吸光度(A)值。 3)细胞的融合: 将SP2/0细胞悬液与脾细胞悬液均匀混合。200 g/min离心5 min，弃去上清，取0.8 mL PEG滴加到细胞中。加入20 mL 1640基础培养基，200 g/min离心8 min弃去上清，HAT培养基混匀，将融合细胞接种到饲养层细胞培养板中，细胞培养箱中培养。 4)单克隆的筛选: 融合10～20 d后，取细胞上清检测，进行两轮筛选。 5)杂交瘤细胞的亚克隆: 将待克隆的杂交瘤细胞悬液滴加到准备好的饲养层细胞中进行培养，显微镜下发现明显的克隆生长后开始检测。 6)单克隆抗体的生产: 液体石蜡接种于健康BALB/c小鼠腹腔内，10 d后腹腔接种3×105个/0.5 mL杂交瘤细胞，观察小鼠腹水产出情况，并做好腹水的采集工作。 7)单克隆抗体亚型的鉴定: 使用小鼠单克隆抗体亚型试剂盒进行鉴定，依照试剂盒说明书进行检测，吸光度(A)值最高的孔对应相应的亚型。

1.2.3 小鼠ERV Gag单克隆抗体特异性的鉴定： 1)ELISA检测： 采用KLH偶联多肽(1 μg/mL)、Gag 194多肽(1 μg/mL)、Gag 194重组蛋白(0.5 μg/mL)、Gag QR多肽(1 μg/mL)和KLH(1 μg/mL)多肽包被孔板。 2)Western blot检测：采用质粒Gag 194、Gag QR对HEK 293T细胞进行转染(转染时长48 h)，并分别收集转染后的细胞内蛋白、min6细胞内蛋白、Gag 194重组蛋白，以及正常培养的HEK 293T细胞内蛋白。使用5株小鼠ERV Gag单克隆抗体和R187单克隆抗体进行Western blot检测。

1.2.4 内源性逆转录病毒Gag抗原在NOD小鼠胰腺中的表达： 因能自发T1D模拟人患T1D的过程，NOD小鼠一直是用于T1D研究的良好动物模型。C57BL/6小鼠是对照小鼠，此品系小鼠是T1D抗性小鼠。在免疫组织化学实验中，使用生物素化的1F4C8、2D4C6、5F9E4单克隆抗体检测20周龄(T1D发病前期)NOD小鼠、3周龄(幼龄)NOD小鼠、20周龄C57BL/6小鼠和3周龄(幼龄)C57BL/6小鼠胰腺中Gag 蛋白的表达情况。

2 结果

2.1 ERV Gag单克隆抗体制备结果

2.1.1 ERV Gag蛋白结构分析和抗原多肽设计：位于4号染色体108152234-108153844处的CS4.108x基因作为目前已知的一个ERV gag基因，gag 194基因(克隆于NOD小鼠胰岛)序列与其具有极高的同源度。gag QR基因从min6细胞中克隆所得。3个基因产物的氨基酸序列比对结果如图1所示。图2为ERV Gag 194抗原表位预测结果。最终选择Gag 194 193-210号多肽序列(193-VSRLRGRRDPPAVDSTTS-210)为小鼠ERV Gag单克隆抗体的制备靶点， 相应的Gag QR基因的多肽序列为：193-VSRLRGKRDPPAADSTTS-210。

The omitted parts in Gag 194 or Gag QR were identical amino acids to CS4.108x图1 氨基酸序列比对结果Fig 1 Amino acid sequence alignment

图2 ERV Gag 194抗原表位预测Fig 2 Epitope prediction of ERV Gag 194

2.1.2 第3次加强免疫小鼠血清ELISA效价的检测结果： 第3次加强免疫后BALB/c小鼠血清效价检测结果如图3所示。

2.1.3 细胞融合复筛的结果：首次筛选中有14株阳性率较高的克隆株，复筛中有5株阳性率较高的克隆株：1F4、2D4、3C3、4D6、5F9。细胞融合复筛结果如图4所示。

2.1.4 抗体效价检测结果: 图5为抗体效价检测结果。

2.1.5 单克隆抗体亚型鉴定: 制备的5株小鼠ERV Gag单克隆抗体均为IgG2b亚型。图6为小鼠ERV Gag单克隆抗体亚型鉴定结果。

A.serum ELISA test for binding to the Gag peptide; B.KLH-peptide conjugate; sera of 5 BALB/c mice were collected after the third immunization (100 ng antigen per well); PC.positive control; NC.negative control; K.kilo

图4 细胞融合复筛结果Fig 4 Screening after cell fusion

A.Gag peptide package board(50 ng antigen per well); B.KLH antigen coating plate(50 ng antigen per well)图5 抗体效价检测结果Fig 5 Evaluation of antibody titers

A.heavy chain; B.light chain图6 单克隆抗体亚型鉴定结果Fig 6 Identification of Ig subtype of the mAbs

2.2 ERV Gag单克隆抗体特异性检测

2.2.1 ELISA检测的结果: 5株小鼠ERV Gag单克隆抗体对Gag 194来源的多肽或重组蛋白均具有较高的敏感度，而多Gag QR来源的多肽敏感度较低。图7为小鼠ERV Gag单克隆抗体ELISA检测结果。

2.2.2 Western blot检测的结果: 1F4C8、2D4C6、3C3B9和5F9E4抗体与Gag 194重组蛋白能发生特异性结合，其中1F4C8、2D4C6、5F9E4抗体还能特异性结合Gag 194质粒转染48 h后的HEK 293T细胞内Gag蛋白。除此之外，1F4C8、2D4C6抗体对Gag QR质粒转染48 h后的HEK 293T细胞内Gag蛋白也能产生特异性结合。在多次重复实验中，4D6B3小鼠ERV Gag单克隆抗体均不识别任何上样蛋白，这可能因为4D6B3小鼠ERV Gag单克隆抗体仅识别Gag多肽而无法结合蛋白。R187抗体是Gag大鼠的单克隆抗体，能够特异性识别Gag QR来源的Gag蛋白。图8为小鼠ERV Gag单克隆抗体蛋白质印迹实验结果。

2.3 ERV Gag抗原在NOD小鼠胰腺中的表达

免疫组织化学检测的结果： 无论是幼龄还是T1D发病前期的NOD小鼠胰腺均可检测到Gag抗原的表达，但C57BL/6小鼠胰腺未检测到Gag抗原。(本实验背景呈淡粉色，这是因为本单克隆抗体由小鼠生产制备而成，与检测样本(小鼠胰腺冰冻切片)存在交叉反应所导致的)。图9为免疫组织化学实验结果。

3 讨论

根据前期研究表明，NOD小鼠的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可释放外泌体(exosomes, EXOs)，自身反应性B细胞和T细胞能被释放的EXOs有效激活，但C57BL/6小鼠的MSCs所释放的EXOs并不能引发此诱导反应。通过蛋白质质谱分析EXOs蛋白成分时发现，ERV 的Gag和 Env抗原均在MSCs分泌的EXOs中高表达。通过构建gagKD和gagWT的EXOs，在相关检测实验中发现gagWT的EXOs能更有效的激活CD4+T细胞。据此推测，Gag极有可能是一个重要的T细胞抗原。单抗则是进一步研究Gag抗原的必需材料，于是分析Gag 194抗原位点，选取单克隆抗体制备靶点(Gag 194:193-VSRLRGRRDPPAVDSTTS-210)，并成功制备了5株(1F4C8、2D4C6、3C3B9、4D6B3、5F9E4)小鼠ERV Gag单克隆抗体，5株抗体亚型均为IgG2b型。

制备的小鼠ERV Gag单克隆抗体均能较好的识别Gag 194来源的抗原。R187可识别多个小鼠白血病病毒(murine leukemia virus，MuLV)的Gag抗原[11]。而gag QR的基因序列与MuLV gag的基因序列高度同源。因此R187抗体能够特异性结合Gag QR来源的蛋白。通过比较，2D4C6抗体特异性更好，对Gag 194 和Gag QR来源的Gag蛋白均能有效结合。

无论处于何周龄的NOD小鼠，其胰腺均可检测到ERV Gag抗原，但在胰岛炎性反应发生的淋巴细胞浸润区域内未检测到ERV Gag抗原。此外，NOD小鼠的胰岛MSCs分泌的EXOs也表达ERV Gag蛋白，由此可推断胰岛MSCs是表达此抗原的重要细胞群或之一， 然而此处并不能排除部分胰岛内分泌细胞也存在表达Gag抗原的可能性。C57BL/6小鼠的胰腺均不表达ERV Gag抗原。由此可见，ERV Gag抗原在NOD小鼠幼年时期的胰腺中就已经开始表达，这提示了ERV Gag抗原是NOD小鼠的特殊抗原，且在NOD小鼠幼年时期此抗原就开始表达，可以推测该抗原的表达与T1D发生有一定的相关性。

A.1F4C8; B. 2D4C6; C. 3C3B9; D. 4D6B3; E. 5F9E4; the values shown were average of two repeated wells; similar data were observed in two separate experiments

综上所述，Gag 194抗原在NOD小鼠体内是否比其他ERV抗原(如Gag QR)有更的免疫刺激作用还需进一步研究，而新制备的小鼠ERV Gag单克隆抗体特别是2D4C6为此研究提供了一种有效工具。

M.protein marker; 1.recombinant protein; 2.293T-transfected by Gag 194; 3.293T-transfected by Gag.QR; 4.Min6 cells; 5.293T (-).A.anti-Gag mAbs; B.Coomassie Brilliant Blue staining

Dashed circles indicated islets, yellow arrows indicated islet areas infiltrated by lymphocytes(×20); A.1F4C8; B.2D4C6; C.5F9E4