反相聚合物填料层析纯化万古霉素工艺研究

张爱玲，王冬燕，韩笑笑，王圆超，张志江*，葛鹍鹏*

(1.华北制药集团新药研究开发有限责任公司 微生物药物国家工程研究中心 河北省工业微生物代谢工程技术研究中心，河北 石家庄 052160；2.华北制药华胜有限公司，河北 石家庄 052160)

万古霉素(Vancomycin，分子结构式如图1所示)是由东方拟无枝酸菌发酵产生的一种糖肽类抗生素[1]，分子式为C66H75Cl2N9O24，分子量为1 449.25，为白色或类白色粉末,早期由美国礼莱公司开发生产，1958年获FDA批准上市[2]。万古霉素对耐甲氧西林葡萄球菌(MRSA)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)、肺炎链球菌及肠球菌等多数革兰氏阳性菌均有良好的抑制作用，因其不易产生细菌耐药性，曾被誉为“人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线”[3]，通常不作为一线抗菌药物应用，只在常用抗菌药物无效时应用。近年来，随着耐药细菌感染病例增多，万古霉素市场需求量逐渐增大，同时对万古霉素纯度也有了更高的要求。

图1 万古霉素的分子结构式Fig.1 Molecular formula of Vancomycin

万古霉素可通过优化的发酵工艺进行规模化生产[4]，其发酵液中除目标产物外，还含有金属离子、菌丝体、多种蛋白质、色素等杂质。万古霉素的分离纯化方法有树脂提取法、沉淀法、柱层析法、盐析法、膜过滤法等[5]。规模化生产常采用陶瓷膜[6]或超滤系统[7]过滤万古霉素发酵液。过滤后的万古霉素发酵液通常经树脂提取、浓缩、脱色等预处理过程得到万古霉素粗品，然后采用柱层析法获得高纯度的万古霉素。李宁等[8]采用混合型阳离子交换层析介质获得纯度95%以上的万古霉素。

反相色谱法因柱效高、分离能力强等优势，是分离纯化蛋白、多肽类药物使用较为广泛的一种方法。近年来，国内单分散多孔反相聚合物微球的制备及其应用越来越多[9]。作者以国产单分散反相聚合物填料为层析介质，甲醇-水溶液为流动相，以万古霉素的纯度及收率为评价指标，采用柱层析法纯化万古霉素粗品，考察洗杂剂浓度及体积、洗脱剂浓度、洗杂及洗脱流速、载样量对层析纯化万古霉素的影响。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

反相聚合物填料，苏州纳微科技有限公司。

万古霉素粗品(纯度93.20%)，华北制药华胜有限公司；甲醇，分析纯，天津永大化学试剂有限公司；蒸馏水，自制。

岛津LC-2030C型高效液相色谱仪，岛津企业管理(中国)有限公司；KQ-500B型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；玻璃层析柱(Φ50 mm×250 mm)。

1.2 方法

1.2.1 装柱

用蒸馏水清洗层析柱，并充分润湿层析柱内壁。将反相聚合物填料搅拌均匀，超声10 min除去气泡。层析柱上端进口连接加料装置，一次性将填料转入层析柱中，连接进料管进蒸馏水，在快流速下将填料压实，层析柱填充好填料。

1.2.2 平衡

用蒸馏水洗去填料保护液，再用1.0 BV蒸馏水平衡层析柱，待用。

1.2.3 上样

称取万古霉素粗品，用蒸馏水溶解并配制浓度为35 mg·mL-1的样品溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤。将样品溶液以2 BV·h-1的流速加入层析柱中。

1.2.4 洗脱

上样后，先用低浓度甲醇-水溶液洗杂，再用高浓度甲醇-水溶液洗脱，分段收集洗脱液，取样检测，合并万古霉素纯度≥96%的洗脱液。采用高效液相色谱仪检测洗杂液中的杂质浓度、洗脱液中的万古霉素浓度，按式(1～2)计算杂质降低率(%)、万古霉素收率(%)。

(1)

(2)

式中：c杂为洗杂液中的杂质浓度，mg·mL-1；c杂0为样品溶液中的杂质浓度，mg·mL-1；V杂为洗杂液体积，mL；V0为样品溶液体积，mL；cVB为纯度≥96%的洗脱液中的万古霉素浓度，mg·mL-1；cVB0为样品溶液中的万古霉素浓度，mg·mL-1；VVB为纯度≥96%的洗脱液体积，mL。

2 结果与讨论

2.1 洗杂剂浓度及体积的选择

洗杂过程是用较低浓度的溶剂体系将万古霉素粗品溶液中与填料结合力较弱的杂质洗脱下来，以利于洗脱时获得更高的产品纯度和收率。为了更容易实现规模化生产，方便操作，洗杂剂与洗脱剂采用相同的溶剂体系，即甲醇-水溶液。

按1.2.3操作，上样结束后，分别用3%、4%、5%、6%、7%甲醇-水溶液进行洗杂实验，洗杂剂体积3 BV，洗杂剂流速2 BV·h-1，收集洗杂液，取样检测杂质及万古霉素浓度，计算杂质降低率和万古霉素损失率，结果见表1。

由表1可知，用3%～6%甲醇-水溶液洗杂时，随着甲醇浓度的增加，杂质降低率和万古霉素损失率均升高；用7%甲醇-水溶液洗杂时，由于更多的万古霉素被洗下来，杂质降低率下降,万古霉素损失率上升。本着洗杂过程要洗掉更多的杂质，而尽量减少万古霉素损失的原则，选择6%甲醇-水溶液作为洗杂剂。

表1 洗杂剂浓度对洗杂效果的影响/%

按1.2.3操作，上样结束后，用6%甲醇-水溶液分别以2.0 BV、2.5 BV、3.0 BV、3.5 BV、4.0 BV、4.5 BV洗杂，收集洗杂液，取样检测杂质及万古霉素浓度，计算杂质降低率和万古霉素损失率，结果如图2所示。

图2 洗杂剂体积对洗杂效果的影响Fig.2 Influence of volume of agent for washing impurity on removal impurity

由图2可知，随着洗杂剂体积的增加，杂质降低率和万古霉素损失率均逐渐升高；当洗杂剂体积为3.5 BV时，杂质降低率较高，万古霉素损失率较低；继续增加洗杂剂体积，杂质降低率升幅变小，而万古霉素损失率明显升高。因此，洗杂剂体积选择3.5 BV。

2.2 洗脱剂浓度的选择

洗脱是层析纯化万古霉素的主要过程，采用较高浓度的甲醇-水溶液洗脱万古霉素。

按1.2.3操作，上样结束后，先用3.5 BV的6%甲醇-水溶液洗杂，再分别用10%、11%、12%、13%、14%、15%甲醇-水溶液洗脱，洗脱流速2 BV·h-1，分段收集洗脱液，取样检测，合并万古霉素纯度≥96%的洗脱液，计算万古霉素收率，结果如图3所示。

由图3可知，随着洗脱剂甲醇浓度的增大，洗脱液中的万古霉素纯度缓慢下降，收率先升高后下降，在甲醇浓度为12%时，收率最高。洗脱剂甲醇浓度较小时，洗脱液中的万古霉素纯度较高，但收率较低，这是由于部分万古霉素吸附于填料上，没有被完全洗脱下来。洗脱剂甲醇浓度偏大时，洗脱液中的万古霉素纯度有所降低，收率明显降低，这是由于，甲醇浓度增大，更多的杂质被洗脱下来，高纯度部分减少。为了获得高纯度和高收率，洗脱剂选择12%甲醇-水溶液。

图3 洗脱剂甲醇浓度对万古霉素纯度及收率的影响Fig.3 Influence of methanol concentration in eluent on purity and recovery of Vancomycin

2.3 洗杂、洗脱流速的选择

按1.2.3操作，上样结束后，先用3.5 BV的6%甲醇-水溶液洗杂，再用12%甲醇-水溶液洗脱，洗杂、洗脱流速(BV·h-1)分别为1.75、2.00、2.25、2.50、2.75、3.00，分段收集洗脱液，取样检测，合并万古霉素纯度≥96%的洗脱液，计算万古霉素收率，结果如图4所示。

图4 洗杂、洗脱流速对万古霉素纯度及收率的影响Fig.4 Influence of flow rate of impurity-washing and elution on purity and recovery of Vancomycin

由图4可知，在洗杂、洗脱流速为1.75～2.25 BV·h-1时，万古霉素纯度与收率变化不明显，纯化效果较理想；而洗杂、洗脱流速超过2.50 BV·h-1后，由于流速过快，两相间的平衡速度受到影响，纯化效果明显变差，收率降低。综合考虑层析效率、万古霉素纯度及收率等因素，洗杂、洗脱流速均选择2.25 BV·h-1。

2.4 载样量的选择

在层析分离纯化的工业生产中，在保证分离纯化效果的基础上，载样量决定层析效率。分别选用2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的载样量，先用3.5 BV的6%甲醇-水溶液洗杂，再用12%甲醇-水溶液洗脱，洗杂、洗脱流速均为2.25 BV·h-1，分段收集洗脱液，取样检测，合并万古霉素纯度≥96%的洗脱液，计算万古霉素收率，结果如表2所示。

表2 载样量对万古霉素纯度及收率的影响/%

由表2可知，载样量偏小时，万古霉素纯度高，但收率较低，层析效率低；载样量过大时，收率高，层析效率较高，但纯化效果变差，纯度低；4.0%的载样量有超出了填料负荷量的趋势。综合考虑层析效率、杂质含量、万古霉素纯度及收率等因素，载样量选择3.5%。

2.5 优选工艺验证

在优选工艺条件下进行3批次层析工艺验证，按照3.5%的载样量称取万古霉素粗品，用蒸馏水溶解并稀释至浓度为35 mg·mL-1，上样后，在2.25 BV·h-1的洗杂、洗脱流速下，先用3.5 BV的6%甲醇-水溶液洗杂，再用12%甲醇-水溶液洗脱，分段收集洗脱液，取样检测，合并万古霉素纯度≥96%的洗脱液，计算万古霉素收率，结果如表3所示。

表3 优选工艺验证结果/%

由表3可知，采用优选的层析工艺参数进行万古霉素粗品分离纯化，工艺稳定，万古霉素收率较高，纯度高、杂质含量低，层析效率较高。

3 结论

采用反相聚合物填料对万古霉素粗品进行层析纯化，得到较佳工艺条件为：载样量3.5%，洗杂、洗脱流速2.25 BV·h-1，先用3.5 BV的6%甲醇-水溶液洗杂，再用12%甲醇-水溶液洗脱。层析纯化后的万古霉素纯度由原来的93.20%提高到98.22%，收率达81%以上。该层析工艺除杂效果明显，可在较高的效率下获得高纯度万古霉素，有较高的应用价值。