快速协同浊点萃取-高效液相色谱法测定水中4种苯酚类化合物

杨晓颖， 姜 勋， 罗幸玲， 叶小华， 王 梅*

(广东药科大学公共卫生学院，广东广州 510310)

苯酚和对苯二酚、间苯二酚、邻苯二酚是重要的化工原料，也是环境水体中常见的有机污染物。因其具有高毒性和难降解性，已被多个国家和地区认定为环境污染物并限制排放[1,2]。酚类化合物具有致癌、致畸和致突变的潜在毒性，会对人体健康和生态环境造成威胁。因此，有必要建立准确、灵敏、高效的分离分析方法，对环境水中酚类化合物进行监测。浊点萃取(CPE)应用于酚类化合物的预富集已有不少报道，但大多存在以下不足：单纯使用表面活性剂对具有一定亲水性的苯酚类化合物(如苯酚、苯二酚)直接进行萃取，导致总体萃取效果不佳；步骤较繁琐，耗时较长。

快速协同浊点萃取(RS-CPE)是在经典CPE基础上，通过加入协同诱导剂，室温下即可产生浊点现象，快速完成对目标物分离萃取和富集过程的新型样品预处理方法，具有快捷、经济、环保等优点。RS-CPE由温晓东等[3]于2011年提出，与分光光度法联用测定铜。此后该课题组[4 - 9]、Rahnama[10,11]、杨静[12]等学者将此技术拓展应用于铅、铋、镍、硒、钴和铬等其他金属离子的测定。目前所报道方法通常以Triton X-114、Triton X-100为萃取剂，以辛醇为协同诱导剂，通过添加络合剂，如二乙基二硫代氨基甲酸钠、双硫腙、1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚、2,2′-呋喃二肟等，将金属离子转化为可被表面活性剂相萃取的疏水性物质。在酚类污染物测定方面，我们课题组选用PEG-6000作萃取剂，克服Triton X系列所带来的干扰，通过加入辛醇，将其浊点(100 ℃)降至室温，成功建立了与荧光分光光度法联用检测苯酚的方法。

选择合适的协同诱导剂是在常温下实现RS-CPE的关键，我们课题组通过实验发现，合适的协同诱导剂应具有以下共通性：(1)具有适当的疏水性，可降低浊点温度；(2)粘度低，能直接稀释富集相；(3)在特定条件下能与水溶液快速分离并快速完成萃取的过程。乙腈与水互溶，粘度小，是一种同时具有亲水性和疏水性的两亲性极性非质子有机溶剂，可作为高效液相色谱的流动相；也常应用于各种样品前处理中。此外，与传统液-液萃取法中常用的有机溶剂相比，乙腈危害低，因此成为研究者使用有机溶剂的首选[13 - 15]。乙腈与水混溶时形成的是微观不均一的溶液，这为乙腈/水溶液产生相分离，实现对疏水性和亲水性的萃取提供了理论依据[16]。因此，若乙腈能应用于RS-CPE中，将会改善其萃取效果。目前尚未见乙腈RS-CPE应用于萃取苯酚类化合物的报道。本研究建立了以乙腈作协同诱导剂，测定水中4种苯酚类化合物的RS-CPE-HPLC新方法。对协同诱导剂、表面活性剂、络合剂等影响因素进行优化，并将该方法应用于实际工业废水中4种苯酚类化合物的测定。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

LC-20A型高效液相色谱仪、Shim-pack VP-ODS型C18色谱柱、RF-10AXL型荧光检测器(日本，岛津公司)；F-2500型荧光分光光度计(日本，日立高新技术公司)；Synergy超纯水系统(美国，Merck Millipore公司)。

仲醇聚氧乙烯醚15-S-7(Tergitol 15-S-7)、磷酸三丁酯(TBP)均购自美国Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈均购自上海安谱公司；邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、苯酚(纯度为99%，均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司)；乙酸(天津，科密欧公司)。以上试剂纯度均在分析纯以上，实验用水均为Synergy超纯水机系统制备。实验所用器皿均用10%硝酸+10%乙醇溶液浸泡12 h后,超声清洗20 min，然后依次用自来水、超纯水清洗，晾干待用。

1.2 实验方法

1.2.1 高效液相色谱条件流动相A：甲醇；流动相B：乙腈；流动相C：1%乙酸水溶液；流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为10.0 μL。采用梯度洗脱程序：0～6 min，A∶B∶C=20∶20∶60；6～7 min：A上升至65%；7～12 min：A∶B∶C=65∶20∶15；12～13 min：A下降至20%；13～20 min：A∶B∶C=20∶20∶60。检测波长程序为：0～3.8 min：激发波长/发射波长为295/325 nm，3.8～20 min：激发波长/发射波长为275/305 nm。

1.2.2 苯酚类化合物标准溶液的配制1.00 mg/mL的4种苯酚类化合物的各标准储备液配制：分别准确称取25.00 mg的4种目标物标准品于4个25.00 mL容量瓶中，用纯甲醇定容至刻度并密封保存于4 ℃冰箱中。5.00 mg/L的4种苯酚类化合物混合标准工作液配制：分别取50.0 μL(1.00 mg/mL)的上述4种苯酚化合物的标准储备液于10.00 mL容量瓶中，用纯甲醇定容至刻度并密封保存于4 ℃冰箱中。

1.2.3 快速协同浊点萃取过程分别移取50.0 μL 5.00 mg/L的4种苯酚类化合物混合标准溶液或者取7.0 mL水样至10.0 mL离心管中，依次加入Na2SO40.28 g，20% Tergitol 15-S-7溶液1.0 mL，乙腈1.0 mL，磷酸三丁酯0.5 mL，用HCl将溶液pH调节至4.0，并用超纯水定容至10.0 mL。随后旋紧瓶盖，振荡摇匀，并以3 500 r/min转速离心5 min加速分相，离心后直接取上层富集相过滤，进行HPLC检测。

1.2.4 样品制备自来水和工业废水样品用0.45 μm水系滤膜(津腾，混合纤维素膜，Φ=50 mm)过滤后，贮存于4 ℃冰箱中，尽快测定。

2 结果与讨论

2.1 络合剂的选择与优化

苯酚类化合物作为亲水性较强的极性物质，在RS-CPE过程中需要使用适当的络合剂与之形成疏水性强的络合物，才能更好地被萃取进入富集相中。磷酸三丁酯作为一种中性磷氧类萃取剂，常被用作多种金属、酚类化合物的络合剂[17,18]。因此，本研究选择磷酸三丁酯作络合剂并考察其用量对目标物萃取的影响，结果如图1所示。由图可见，使用0.5 mL磷酸三丁酯时，所得峰面积最大，继续增加其用量则峰面积基本保持不变，说明0.5 mL即可使目标物完全被络合。因此，选择0.5 mL磷酸三丁酯作后续研究的最优条件。

2.2 协同诱导剂的选择与用量

为选择合适的协同诱导剂，本实验对甲醇、乙醇、乙腈进行了评估，以简化CPE过程。将甲醇、乙醇、乙腈分别与0.5 mol/L Na2SO4结合，发现甲醇不能将浊点温度降至室温，也未观察到浑浊；加入3.0 mL乙醇则形成了大量富含表面活性剂的相；而随着乙腈体积的增加，体系的浊点温度在逐渐降低。此外，与乙醇相比，乙腈与HPLC的相容性更好，且产生的富表面活性剂相体积较小。分析原因可能是乙腈的加入改变了溶液的极性、溶解度、密度等相关参数，并且在电解质盐析的作用下，乙腈的弱亲水基氰基与水的作用力被打断，从而为表面活性剂提供一个疏水作用力，间接影响胶束的临界胶束浓度、胶束大小以及析相行为[19]。乙腈自身具有一定的疏水性和萃取目标物的能力，故其还可以辅助萃取提高萃取率；并且由于乙腈的粘度小，少量的乙腈溶解于表面活性剂富集相中可起到降低富集相粘度的效果，萃取后的富集相可直接过滤后进行HPLC检测。故选用乙腈为RS-CPE的协同诱导剂。

实验对乙腈用量进行探讨(图2)，当乙腈用量为0～1.0 mL时，4种苯酚类化合物的峰面积逐渐增大，并保持相对平稳状态，1.5～2.5 mL开始下降。可能是少量的乙腈协同辅助萃取效果较差，所得富集相较粘稠，需进一步稀释；然而大量的乙腈会增大富集相体积，稀释了目标物，使萃取率下降。综合考虑环保、经济与实验效果，最后选定1.0 mL的乙腈进行后续研究。

图1 磷酸三丁酯(TBP)对4种苯酚类化合物萃取率的影响Fig.1 Effect of tributyl phosphate (TBP) on the extraction of four phenolic compounds

图2 乙腈对4种苯酚类化合物萃取率的影响Fig.2 Effect of acetonitrile on the extraction of four phenolic compounds

2.3 表面活性剂用量

RS-CPE中表面活性剂的用量是影响萃取效率和富集倍数的重要因素之一。Tergitol 15-S-7因不含苯环结构，不干扰4种目标物的HPLC检测，同时其支链少，对目标物的增溶能力强，所得的富集相体积较小，可获得较高富集倍数，本研究选用Tergitol 15-S-7作萃取剂。

实验分别考察了0～1.25 mL 20%Tergitol 15-S-7对目标物萃取效果的影响。如图3所示，4种目标物的峰面积随萃取剂用量的增加而逐渐上升，当用量达到1.0 mL后，峰面积保持平稳。因此，选择20%Tergitol 15-S-7用量为1.0 mL。

2.4 溶液pH的优化

溶液pH值在RS-CPE过程中起着至关重要的作用，目标分析物含有羟基，其存在状态会随溶液pH的改变而改变。此外，pH值过高或过低也会导致苯酚类化合物与磷酸三丁酯形成的络合物不稳定或发生其他反应，影响萃取效果。在确保其他条件一致的情况下，用HCl、NaOH溶液调节溶液的pH，考察了溶液pH在2.0～9.0范围内，4种苯酚类化合物萃取率的变化情况(图4)。结果表明，4种目标物的萃取率在pH=2.0～8.0范围内相对稳定，在pH=9.0时苯酚和间苯二酚有轻微降低的趋势，邻苯二酚和对苯二酚下降明显，故选溶液pH=4.0作最佳实验条件进行后续研究。

2.5 电解质种类与浓度的选择

浊点萃取时，添加适量电解质会迫使胶束中的氢键断裂并使疏水基团脱离水相，可降低表面活性剂的浊点温度、减小凝聚相体积、改变主体水相的密度，从而加速分相。前期实验探索了4种常用NaCl、Na2CO3、Na2SO4、Na3PO4对浊点温度和目标物萃取效果的影响。结果显示Na2SO4效果最佳，故选择Na2SO4为电解质增强离子强度。同时考察了Na2SO4浓度范围在0～0.7 mol/L时对目标分析物萃取效果的影响，结果显示，萃取率随Na2SO4浓度的增加而增加，至0.2 mol/L时，萃取率达到最大，之后基本保持不变。因此实验选择无水Na2SO4最佳浓度为0.2 mol/L。

图3 20% Tergitol 15-S-7对4种苯酚类化合物萃取率的影响Fig.3 Effect of 20% Tergitol 15-S-7 on the extraction of four phenolic compounds

图4 溶液pH对4种苯酚类化合物萃取率的影响Fig.4 Effect of solution pH on the extraction of four phenolic compounds

2.6 离心转速与时间的优化

离心可使分散在溶液中的萃取剂聚集，促进萃取剂与水相的分离。但离心时间过长，温度升高，可能会使表面活性剂熔化而发生损失[20]，导致萃取率下降；若离心时间过短则会导致相分离不完全。实验结果表明，离心转速与时间对4种目标物萃取率的影响均不大，且离心转速为3 500 r/min，离心时间为10 min时，即可获得澄清的富集相和水相，故选该条件用于后续实验。

2.7 方法评价

以4种苯酚类化合物的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，峰面积的倒数作权重，做线性回归方程，结果如表1所示。对苯二酚、间苯二酚、邻苯二酚和苯酚在0.1～191 μg/L浓度范围内具有良好线性，线性相关系数(r)均大于等于0.9996。分别以3倍和10倍的信噪比计算方法的检出限和定量限，4种目标物的检出限范围为0.02～0.04 μg/L，定量下限为0.07～0.13 μg/L。同时，为了考察该方法的精密度，在最佳的实验条件下，对4种苯酚类化合物的浓度为25.0 μg/L混合标准溶液平行萃取测定6次，所得相对标准偏差均小于2.58%，说明该方法的重现性高，精密度好。此外，在最佳实验条件下，4种苯酚类化合物的富集倍数为8.68～9.96，萃取率高达86.8%以上。

表1 4种苯酚类化合物乙腈RS-CPE方法的分析特征、萃取率和富集倍数

2.8 方法的实际应用

为了验证该方法的实际应用性，在优化的实验条件下，对采集的7份工业废水和1份实验室自来水水样进行检测，结果见表2。在样本工业废水4、5、6中检测到苯酚浓度为1.06～5.04 μg/L，在工业废水7中检测到邻苯二酚和苯酚浓度分别为1.52 μg/L和5.37 μg/L，4种目标物的样品加标回收率在93.9%～107%之间，相对标准偏差均小于5.53%，表明该方法适用于实际环境水样中苯酚类化合物的分析检测，4种苯酚类化合物的空白水样和加标水样的色谱图见图5。

表2 4种苯酚类化合物水样检测结果和加标回收率±RSD(%，n=3)

(续表3)

图5 经RS-CPE(乙腈)后的空白水样和加标水样色谱图Fig.5 Chromatograms of blank and spiked sample after acetonitrile RS-CPEA:the addition of 25 μg/L mixed standard solutions,B:the addition of 5 μg/L mixed standard solutions,C:the blank water sample.

2.9 与其他方法的比较

将本方法与其他方法进行对比(表3)，本实验通过使用协同诱导剂，省去了水浴和稀释步骤，更为简捷，1 min内即可同时完成对目标物的萃取，8 min可完成整个前处理过程，相较于On-line FI-ME、UA-CPE，特别是SPE有突出优势。而且所用的试剂均已商品化，可购买且价格低廉，不需要花费长时间进行前期制备，重复性好。其次，本实验尽管获得的富集倍数不高，但其检测限较低，同时在实验过程中选用环保的表面活性剂作萃取剂，减少了有毒有害有机溶剂的使用，更符合“绿色化学”的理念。

表3 不同方法测定4种苯酚类化合物的比较

3 结论

本实验表明，乙腈作为一种新型的协同诱导剂，不仅可以辅助降低浊点、稀释富集相，还可以协同萃取，提高萃取率。本文成功将乙腈RS-CPE方法应用于分析测定环境水样中4种苯酚类化合物(邻/间/对苯二酚和苯酚)，取得了较为满意的结果。该方法简单、灵敏、成本低、省时、重现性良好；同时也符合绿色环保的要求，因此在分析测定痕量污染物中有较好的应用前景。