非编码RNA与青光眼的研究进展

秦博 陈宇虹 雷苑

(复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科 上海 200031)

青光眼是一种不可逆的、进行性的视神经退行性疾病，是全世界第2位致盲性眼病[1]，其中，原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma ，POAG)是最常见的原发性青光眼类型。目前全球POAG患者的数量约为7 600万人，预测到2040年，全球青光眼的患者将增加到1.1亿[2]。青光眼的发病机制复杂，已知青光眼的视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell，RGC)发生凋亡引起视觉功能障碍，而眼压升高是其中最主要危险因素。近年来研究发现，非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)在青光眼的发生、发展过程中起重要作用。

ncRNA是由基因组转录的不具有编码蛋白质功能的RNA，可以影响基因的转录后修饰并调节表观遗传变化，从而在生理和疾病发展中发挥重要的作用。根据ncRNA的功能及核苷酸(nt)的长度，对其进行分类：小于 200 nt的ncRNA包括微小RNA(microRNA，miRNA)、转运RNA(transfer RNA，tRNA)、小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)等；大于 200 nt的ncRNA包括核糖体RNA (ribosomal RNA，rRNA) 、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，以及特殊的环状RNA (circular RNA，circRNA)[3]。随着测序技术的进步，ncRNA的数据库也在不断更新和完善[4]。ncRNA在生物发育和疾病中的机制网络在不断探索中，目前的研究多集中在具有调控功能的miRNA、lncRNA和circRNA上[5]。目前，临床上延缓或阻止青光眼进展的主要方法是通过手术和药物治疗来降低眼压[6-7]。随着对ncRNA与青光眼研究的不断深入，ncRNA有望成为青光眼诊断或治疗的新靶点，给青光眼的诊断、治疗提供了新的思路和方法。本文将分别从miRNA、lncRNA、circRNA与青光眼相关研究进行综述，以期为将来的临床和科研提供参考。

1 miRNA与青光眼

miRNA是在真核生物中发现的一类内源性单链结构小分子RNA，成熟的miRNA大小长18～25 nt，不具有开放阅读框。miRNA的经典生物学功能是结合mRNA的3'-UTR种子区，碱基配对引导沉默复合体降解mRNA或抑制mRNA翻译，从而下调其靶基因在胞质内的表达[8]，这种miRNAmRNA转录后调节机制对于基因的表达调控起到重要作用。1.1青光眼中差异表达的miRNA 成熟的miRNA在细胞质中形成，其中一些分泌到细胞外，在细胞外环境中稳定存在，这类miRNA称为循环miRNA。在青光眼患者的房水或者血液中，部分循环miRNA的表达水平被发现有显著改变，这些miRNA经过筛选和深入研究可能成为青光眼诊断和治疗的重要靶点[9]。通过对不同视野损害程度的POAG患者房水进行miRNA二代测序及分析，数据显示中度和重度视野缺损的POAG组存在16个差异表达的miRNA。基于 KEGG 数据库进一步对差异表达的miRNA靶基因进行通路富集分析，结果提示硫胺素代谢、嘌呤代谢和转录失调可能在POAG的发病和进展中发挥作用[10]。对于不同类型的青光眼患者，包括POAG、假性剥脱性青光眼 (PEXG)、原发性闭角型青光眼(primary angle closure glaucoma,PACG)，房水miRNA的实时定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)发现miR-1260b在PEXG和PACG中高表达，miR-1260b和miR-6515-3p的表达水平与POAG患者年龄相关[11]。

在临床中，房水仅能在眼内手术时收集到少量样本，而血液样本较房水更容易获得，通过分析比较血液和房水miRNA的表达谱，有希望将血液中miRNA作为青光眼的生物学标志物。有研究[12]在青光眼患者血浆和房水中进行miRNA水平检测，青光眼患者血浆中有20个miRNA比对照组高至少1.5倍，而在房水中这20个miRNA中的6个也高于对照，其中miR-637、miR-1306-5p和miR-3159的组合显示出与青光眼最强的相关性。随后运用生物信息学工具对20个miRNA进行靶标预测，并对青光眼相关的生物学信号通路进行富集分析，预测了包括神经炎症信号传导、神经元型一氧化氮合酶 (neuronal nitric oxide synthases, nNOS)和内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)信号转导以及神经营养蛋白/酪氨酸激酶受体信号转导在内的通路，神经炎症和营养因子与RGC的调控有关，NOS信号通路也被证实与青光眼发病相关。在POAG患者血清中，miR-210-3p显著上调，并且与视野缺损程度和平均视网膜神经纤维层厚度相关，循环miR-210-3p可作为严重视野缺损的POAG潜在诊断标志物[13]。然而，未检测到POAG患者房水中miR-210-3p水平升高，需要进一步的研究来确定miR-210-3p的升高是否为POAG的原因、结果和(或)伴随因素。最近有研究[14]对POAG患者血浆和房水进行小RNA测序，在血浆中没有发现差异表达的miRNA，在房水中有7个差异表达的miRNA，通过ROC分析评估miR-221-3p可能作为生物标志物。这些临床样本研究较少有重复报道的miRNA进行互相验证，可能因为房水获取困难，研究的样本量偏少，目前需要多中心、大样本量的miRNA表达谱研究，以得到更具代表性的结论。

1.2 miRNA对房水流出的调节作用 小梁网是房水流出的主要途径，小梁网细胞、Schlemm管内皮细胞的老化、细胞外基质沉积等病理改变会增加房水流出阻力，从而导致眼压升高。越来越多的研究证实miRNA可以参与小梁网途径的房水引流，改变房水流出阻力，调节眼压。

小梁网细胞外基质的沉积增加房水流出阻力。有研究[15]表明miR-29b可以抑制小梁网细胞中细胞外基质合成和胶 原 蛋 白 沉 积(COL1A1、COL1A2、COL4A1、COL5A1、COL5A2、COL3A1)，以及层粘连蛋白和原纤维蛋白的表达。在慢性氧化应激条件下，miR-29b的下调导致这些基因的表达增加[15]。转化生长因子-β(transforming growth factorβ,TGF-β)可以改变小梁网中细胞外基质的结构，进而影响房水流出的阻力。miR-24靶向FURIN基因，通过抑制激活TGF-β的蛋白酶，下调TGF-β的表达，进而抑制小梁网中细胞外基质的沉积[16]。而miR-483-3p靶向下调Smad4的表达，对小梁网细胞外基质的合成起到抑制作用[17]。

小梁网细胞的收缩可以减小细胞的间隙，进而降低小梁网的通透性和房水流出速率。有研究[18]发现，miR-200c可以抑制与小梁网细胞收缩有关基因的表达(ZEB1、ZEB2、FHOD1、LPAR1/EDG2、ETAR和RHOA)，大鼠眼内注射后miR-200c眼内压降低。而miR-143/145可以通过抑制APRC、PDGFRA和MLCK基因的表达来调节小梁网细胞的收缩力，敲除miR-143/145后的小鼠眼压显著降低[19]。

小梁网和Schlemm管细胞老化增加房水流出通道的阻力，在老化的过程中，miRNA的表达会发生变化，并调节相关基因的表达。在连续传代至衰老状态的小梁网细胞中，miR-146a的表达显著上调，并且miR-146a下调与炎症和细胞衰老有关的基因表达(IL6、IL8、PAI-1、CXCL3、CXCL6和CCL2)[20]。在老化的猪眼角状水丛细胞(angular aqueous plexus cells，AAP细胞，等同于人Schlemm管内皮细胞)中，miRNA芯片分析筛选出miR-21-5p可以调节房水小梁网通路流出系数，进而调节眼压。双荧光素酶检测报告发现PTEN、TIMP3和RhoB是miR-21-5p直接靶标，miR-21-5p可能通过PTEN/Akt/eNOS、TIMP3/MMP9/MMP2、RhoB/ROCK/pMLC三个途径，调节细胞连接黏附、细胞外基质及细胞骨架进而改变房水小梁网流出途径阻力。miR-21-5p可能代表了一种新的青光眼治疗策略，并且有希望替代现有的多药治疗方案[21]。miRNA在体内的转染难度限制了其进一步应用，多巴胺-聚乙烯亚胺纳米颗粒(PDA/PEI NPs)作为miRNA载体，保证较高的转染效率和较低的细胞毒性，并且已证实PDA/PEI NPs/miR-21-5p可以增加AAP细胞的渗透性，促进小梁网途径房水流出，成为一种很有前景的抗青光眼药物[22]。

1.3 miRNA对RGC损伤的调控作用 青光眼RGC的损伤凋亡是青光眼共同且至关重要的病理生理因素，miRNA在青光眼视网膜损伤过程中表达改变并可调节相关信号通路。在青光眼大鼠模型中，视网膜miR-93-5p表达下调，miR-93-5p抑制PTEN的表达，通过磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/mTOR途径影响神经节细胞自噬和凋亡[23]。在慢性青光眼小鼠模型中，miR-149在RGC中表达上调，沉默miR-149可以激活PI3K/Akt信号通路，抑制RGC凋亡[24]。miR-182可以靶向Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)，调节TLR4介导的炎性作用[25]，抑制小胶质细胞的激活，保护RGC免受氧化应激损伤[26]。在小鼠模型中，miR-141-3p的上调抑制了丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路诱导的RGC凋亡，并且miR-141-3p的上调降低血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达，抑制视网膜血管上皮细胞的增殖，这可能在新生血管性青光眼的发病中起重要作用[27]。此外，小鼠RGC中下调miR-200a可以激活MAPK信号通路来增加RGC的凋亡和Müller细胞的失活[28]。在大鼠RGC细胞系中，上调miR-96诱导RGC凋亡，并且与caspase蛋白的激活有关，当caspase-2基因沉默时，miR-96在RGC中的作用消失[29]。miR-19a在RGC成熟时表达下降，减轻了其对PTEN表达的抑制作用，导致神经轴突再生能力下降，miR-19a的过表达可增强RGC的轴突再生能力，表明玻璃体内注射miR-19a可能具有一定的治疗潜力[30]。因此，miRNA可以通过靶向PI3K/Akt、MAPK等多种信号通路参与RGC的自噬，凋亡及神经轴突再生，可能成为青光眼神经保护的新靶点。

2 LncRNA与青光眼

LncRNA是长度大于200 nt的非编码转录物，以此区别与miRNA。lncRNA结构上类似于mRNA，与蛋白质编码mRNA有许多相同的特征，包括均由RNA聚合酶Ⅱ转录、剪接、多腺苷酸化和5′端甲基化[31]。但是，由于缺乏开放阅读框、典型的起始密码子和终止密码子，lncRNA通常不能编码蛋白质[32]。近年来的研究[32]表明，lncRNA通过表观遗传学调控、转录及转录后调控、miRNA表达调控、吸附miRNA等多种层面，参与基因的表达调控，在多种细胞功能中发挥重要作用。

2.1 青光眼中差异表达的lncRNA LncRNA在青光眼患者血清和房水样本中均有差异表达，提示其可能参与青光眼的病理过程。在青光眼病例对照研究[33]中，人们发现患者血清lncRNA MALAT1和ANRIL的表达显著降低，并且MALAT1和ANRIL的表达与患者的进展程度显著相关，它们的联合检测可能成为青光眼患者诊断和严重程度评估的新分子靶标。有研究[34]对POAG患者房水进行lncRNA表达的芯片分析，并使用实时定量PCR证实lncRNA T267384、ENST00000607393和T342877表达显著升高，这些都可能是用于POAG诊断的潜在生物标记。

2.2 LncRNA对房水流出的调节作用 在小梁网房水流出途径中，lncRNA参与调节房水流出阻力。在过氧化氢(H2O2)诱导的小梁网细胞氧化应激模型中，RNA测序发现与TGF-β信号传导密切相关的lncRNA和mRNA表达差异显著。其中，lncRNA TGFβ2-AS1通过激活小梁网细胞中TGF-β2信号通路促进细胞外基质的产生，进而增加房水流出阻力，提示lncRNA TGFβ2-AS1可能参与青光眼病理过程的调节[35]。而lncRNA RP11-820在小梁网细胞氧化应激下显著上调，直接结合miR-3178，调节MYOD1的表达，促进细胞外基质的合成[36]。另外，氧化应激的小梁网细胞中lncRNA ANRIL通过下调miR-7，激活mTOR和MEK/ERK通路，减轻小梁网细胞的氧化损伤[37]。

2.3 LncRNA对RGC损伤的调控作用 在视网膜神经损伤过程中，lncRNA差异表达并通过多种通路对RGC损伤发挥调控作用。CDKN2B-AS，也称为INK4基因座中反义非编码RNA(antisense non-coding RNA in the INK4 locus，ANRIL)，是在CDKN2A和CDKN2B的反义方向转录的lncRNA，是一种公认的肿瘤抑制因子[38]。全基因组关联研究确定了CDKN2B-AS与开角型青光眼高度关联，并在青光眼大鼠模型的视网膜中CDKN2A和CDKN2B表达上调[39]，CDKN2A和CDKN2B位点多态性的改变可以调节细胞周期，导致RGC凋亡和青光眼进展[40-41]。lncRNA GAS5与维持青光眼的RGC存活密切相关，下调RGC的GAS5，可以激活TGF-β途径来促进RGC的存活[42]。大鼠青光眼模型中，GAS5的下调可以导致RGC中EZH2表达增加和ABCA1表达减少，从而减少RGC凋亡[43]。在体外加压培养的RGC中，MALAT1显著下调，MALAT1通过抑制miR-149-5p而促进RGC增殖，抑制其凋亡[44]。在小鼠视网膜缺血/再灌注模型中，lncRNA Mbd2-AL1参与RGC的缺血/再灌注损伤，Mbd2-AL1通过吸附miR-188-3p，抑制肿瘤坏死因子受体相关因子3(Traf3)下调并诱导RGC细胞凋亡[45]。

3 CircRNA与青光眼

CircRNA是具有无5'帽和3'poly-A尾巴的单链共价闭合结构[46]，曾经被认为是异常RNA剪接的副产物，在几乎所有真核细胞中存在，并且表达具有组织或细胞特异性。随着RNA高通量测序技术和生物信息学的进步，circRNA在细胞内的功能逐渐被发现。Hansen等[47]首次报道了称为CDR1as/ciRS-7的circRNA充当miR-7的海绵，调节miRNA的功能。除了充当miRNA海绵的作用外，近年来还发现circRNA可以与RNA结合蛋白相互作用[48]，调节RNA转录或剪接[49]，翻译出短肽或蛋白[50]，参与细胞增殖、分化、迁移、凋亡等一系列生物学过程。CircRNA的异常表达与许多疾病相关，包括癌症、心血管疾病、免疫性疾病、神经退行性疾病等。已经有研究[51-53]发现，circRNA在眼压调节和视网膜神经损伤中发挥作用，circRNA在青光眼发病过程中发挥作用的主要机制是作为miRNA海绵，吸附相关的miRNA并抑制其功能。

3.1 CircRNA对房水流出的调节作用 小梁网细胞在氧化应激条件下，circRNA-HBEGF表达上调并促进细胞外基质的合成。进一步的研究[51]表明，cHBEGF作为miR-646的海绵，通过调节表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)信号通路促进细胞外基质的合成，调节房水流出阻力。

3.2 CircRNA对RGC损伤的调控作用 在视网膜神经损伤过程中circRNA-ZRANB1和circRNA-ZNF609发挥重要功能，干预cZRANB1和cZNF609表达可能成为治疗视网膜神经变性的有效策略[52-53]。在青光眼大鼠模型中，视网膜cZRANB1表达明显上调。此外，POAG患者的房水中cZRANB1表达也明显上调。cZRANB1基因敲低可减少视网膜反应性神经胶质细胞增生和活化，并促进RGC存活。cZRANB1充当miRNA海绵，通过cZRANB1/miR-217/RUNX2网络调节Müller细胞功能[52]。在视网膜神经损伤过程中，视网膜神经胶质细胞cZNF609表达明显上调。cZNF609沉默同样可以减少视网膜反应性神经胶质细胞增生和活化，并促进RGC存活。cZNF609通过充当内源性miR-615海绵来抑制miR-615活性，从而导致镍纹样蛋白(meteorin，METRN)表达增加，METRN的过表达可以部分挽救cZNF609沉默介导的对视网膜胶质细胞增殖的抑制作用[53]。

3.3 CircRNA在视神经发育中的作用 由于circRNA相对稳定，随着年龄增长，circRNA可以不断积累，这提示circRNA可能与年龄相关的神经退行性疾病关联[54]。年龄是青光眼的危险因素之一，老化眼中积累的circRNA可能参与青光眼病理生理过程。有研究[55]发现，果蝇老化的光感受器中积累了几种 circRNA，其中包括影响最佳视觉功能和光感受器健康所需的circRNA。Chen等[56]对小鼠视网膜发育5个阶段的RNA进行测序，提供了视网膜发育过程中第1个circRNA表达图谱，并且在视网膜变性的小鼠模型中发现，circRNA的失调发生在比视网膜变性更早的时间点，提示circRNA在视网膜发育和变性中可能起到的关键生物学作用。

CircRNA具有高度稳定性、广泛的表达以及高度特异性，并且其在青光眼病理过程中的作用逐渐被揭示，有望成为青光眼诊断的标志物和治疗的新靶点。目前，circRNA与青光眼的研究仍然较少，circRNA较长的序列和特殊的成环机制给研究带来挑战，而正在兴起并成熟的第三代测序具有更高的检测率，更长的检测序列，可以检测更多低水平表达的circRNA及线粒体circRNA，对未来circRNA的研究提供更多的技术支撑。

4 展望

ncRNA在细胞功能、分化、凋亡及多种疾病发生发展过程中发挥重要作用，详见表1。随着对于作用机制的进一步深入研究，利用高通量技术手段，例如全转录组测序、RNA芯片等，人们对于真核生物基因表达调控网络有了更加深入的理解。但是，ncRNA在青光眼发病机制的研究仍然十分有限，并且主要集中于经典功能的研究。而ncRNA的非经典功能，如miRNA正向调控基因表达、lncRNA转录及转录后调控、circRNA蛋白调控及翻译功能，在青光眼研究领域仍很缺乏。相信随着逐步深入的研究，ncRNA有希望使其成为青光眼诊断的生物标志物或者治疗靶点，为青光眼的诊断治疗提供新的思路和方法。

表1 青光眼相关的ncRNA

试题8.答案：B。单纯前房积血由于房水循环的快速流动，红细胞难以变性极少引起血影细胞性青光眼；Heinz小体是红细胞脆性增加血红蛋白溢出后，残余变性蛋白附着胞膜内侧形成；钝挫伤伴眼内出血的患者可有眼压升高双峰表现，第一峰由前房积血红细胞堵塞房角引起；第二峰则有玻璃体积血形成的血影细胞堵塞房角引起，且常在伤后的2～4周出现。

试题9.答案：B，母斑病是一组散在分布于神经系统，眼和皮肤的错构瘤，包括Sturge-Weber综合征；神经纤维瘤病；von Hippel-Lindau综合征；结节性硬化等。

试题10.答案：D，眼缺血综合征患者由于颈内动脉血流受累，后睫状动脉低灌注，常有虹膜新生血管，小部分继发新生血管性青光眼。除青光眼性视神经病变外，在眼缺血综合征患者中缺血性视神经病变更为常见。