荷斯坦牛血浆催乳素浓度遗传参数估计及其与PRL、PRLR和TRH基因关联分析

高 清 胡丽蓉 张海亮 张 帆 杨 圳 林逍然 徐 青 郭 刚 刘巧香 王雅春*

(1.中国农业大学 动物科技学院/农业农村部动物遗传育种与繁殖(家畜)重点实验室/ 畜禽育种国家工程实验室，北京 100193； 2.北京交通大学 生命科学与生物工程研究院，北京 100044； 3.北京首农畜牧发展有限公司，北京 100029； 4.北京生物种业创新联合体，北京 101206)

催乳素(Prolactin， PRL)，又称促乳素或泌乳素，是一种单链多肽类激素，因最早被发现与乳腺发育、乳汁分泌密切相关而得名[1]。PRL与生物机体的300多种生物化学反应有关，包括促进乳腺发育和成熟、维持泌乳、促进性腺发育、参与调控性腺功能、调控生殖生理状态、促进体细胞的增殖、调节免疫机能、维持水盐平衡、维持内分泌和新陈代谢及调控行为等，被称为“万能激素”[2-4]。

PRL对奶牛乳腺发育和泌乳发挥着重要作用，促进乳腺导管及腺细胞的增殖分裂与发育成熟，调控泌乳的启动与维持，调节乳汁中蛋白质、乳糖和脂肪的生成[5]。一定浓度的PRL可以显著增加奶牛乳腺上皮细胞的增殖率，对细胞中信号转导及转录因子、L型氨基酸转运蛋白1、活化蛋白、酪蛋白等的表达以及细胞内乳脂和乳蛋白的合成有显著促进作用[6-8]。研究发现，奶牛的胎次、日粮组成、季节、环境温湿度和挤奶刺激等都会对血浆PRL浓度产生影响。有研究发现，血浆PRL浓度在8月、11月和1月之间差异极显著，在热应激状态下显著升高[9]；二胎和三胎奶牛的血浆PRL浓度显著高于四胎奶牛[10]；挤奶前的泌乳刺激对催乳素释放有促进作用[1]。此外，Lupoli等[11]还比较了哺乳奶牛与机器挤奶奶牛的PRL水平差异，哺乳奶牛的PRL浓度显著高于机器挤奶的奶牛。日粮配方也是影响血浆催乳素水平的重要因素，在一定范围内，蛋白质与赖氨酸占日粮的含量与催乳素浓度呈正相关关系[12]。

编码催乳素的基因PRL已经被证实存在于所有的脊椎动物中，牛的PRL基因全长9 388 bp，位于第23号染色体上，包含5个外显子和4个内含子[13]。细胞需要通过表面的催乳素受体(Prolactin receptor， PRLR)结合催乳素来接收信号，故催乳素受体对动物繁殖和泌乳等各种生理功能也会产生较大影响。在哺乳动物中，催乳素受体至少存在两种形态，长型受体可以通过JAK2/STAT5 途径来实现调节基因转录活性，短型受体则不具备该功能，但短型受体可以与长型受体结合形成异二聚体来抑制长型受体的活性，从而对基因的表达和转录产生影响。牛的PRLR基因位于第20号染色体，包含10个外显子和9个内含子[14]。促甲状腺激素释放激素(Thyrotropin releasing hormone， TRH)主要作用于垂体，其受体分布于垂体促甲状腺激素细胞及中枢神经系统，在PRL分泌细胞上也有分布，参与调控促甲状腺激素和PRL的释放[15]。研究表明，泌乳奶牛注射一定剂量TRH后，其血清中的PRL浓度会显著升高[16]；在体外培养的牛脑垂体前叶细胞中添加TRH，细胞中PRL的合成显著增加[17]。由于催乳素具有丰富的生物学功能，已有研究对PRL和PRLR基因和奶牛重要经济性状进行了关联分析，发现多个与产奶量、乳脂和乳蛋白等显著相关的位点[18-21]。然而，关于PRL、PRLR和TRH基因多态性与奶牛PRL浓度的关系尚未见报道。

因此，本研究对北京地区某规模化牧场的泌乳期荷斯坦牛进行血浆PRL浓度测定，通过影响因素方差分析、遗传分析和候选基因关联分析等方法，揭示了不同环境条件和生理阶段下奶牛PRL浓度及其变化规律，估计了奶牛血浆PRL浓度的遗传参数，并分析了PRL、PRLR和TRH基因与奶牛PRL浓度之间的关系。本研究为探索牛血浆PRL浓度的遗传基础和开发育种新性状做出了有益尝试，为筛选具有重要功能分子标记提供了参考。

1 材料与方法

1.1 试验群体

本研究试验群体来自北京市某规模化牧场，该牧场饲养的奶牛品种为荷斯坦牛。本研究在7个不同时期对试验牛群进行了血液样品采集，分别为2014年夏季(178头)、2014年秋季(120头)、2014年冬季(126头)、2017年春季(194头)、2017年夏季(284头)、2017年秋季(116头)、2017年冬季(151头)。试验牛的基本信息(出生日期、产犊时间、胎次和妊娠状况等)和日产奶量记录由牧场提供，系谱数据由北京奶牛中心提供。

1.2 试验方法

1.2.1血样采集及血浆PRL浓度测定

采集血样时，使用一次性采血针和抗凝采血管采集泌乳期荷斯坦牛尾根静脉血 20 mL，其中，10 mL血样3 000 r/min离心15 min，使血浆与血细胞分离，取上层血浆装入经过高压灭菌的1.5 mL离心管中，冷冻保存于-40 ℃，用于测定PRL浓度。血浆PRL浓度由北京金海科隅生物科技有限公司(北京)测定，测定方法为酶联免疫法。另外10 mL抗凝血样用于提取DNA。

1.2.2公牛DNA提取与DNA混池构建

选择70 头无亲缘关系或亲缘关系较远的中国荷斯坦公牛，采用高盐法提取公牛冻精DNA，经DanoDrop2000测定浓度后，随机分为 3 组(20、20和30 头)，依照冻精基因组DNA的浓度等量混合成3个池 DNA，于4 ℃保存备用，种公牛冻精来源于北京奶牛中心。

1.2.3基因多态筛查

下载PRL基因(ENSBTAG00000015274)和PRLR基因(ENSBTAG00000025035)外显子及上下游各2 000 bp 调控区，TRH基因(ENSBTAG00000005306)全序列及上下游各2 000 bp调控区序列，采用NCBI网站的Primer-BLAST(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计引物。PRL、PRLR和TRH基因分别设计了6对、13对和9对引物，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。以混池DNA为模板进行PCR扩增，所用PCR Mix为金牌Mix(北京擎科生物科技有限公司)，PCR反应体系为25 μL，包含1 μL DNA样、22 μL PCR Mix及上下游引物各1 μL。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增成功后，将剩余的PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司测序。通过Chromas 2.4.3软件查看测序峰图及DNAMAN7.0软件进行序列比对，以此判定基因多态性。

1.2.4母牛DNA提取与基因分型

使用DNA试剂盒(DP318，天根生化科技(北京)有限公司)提取母牛血液DNA，检测浓度后调整至50 ng/μL备用。从筛查到的基因多态位点中挑选出位于编码区域或功能区域的位点，设计基因分型引物，采用竞争性等位基因特异性PCR基因分型技术(KASP)对400头母牛进行分型，由中玉金标记(北京)生物技术股份有限公司完成。

1.3 数据整理

本研究于2014和2017年的不同季节测定了北京某规模化牧场472头荷斯坦泌乳母牛共1 169条的血浆催乳素浓度数据，剔除奶牛基本信息缺失数据和各项指标无法对应的个体，共保留468头牛的1 150条数据用于催乳素浓度的影响因素分析、遗传参数估计及关联分析。

本研究中，按照血样采集的年份和季节(3～5月为春季，6～8月为夏季，9～11月为秋季，12～1月为冬季)，将采样季节划分为7个水平，分别为2014年夏季、2014年秋季、2014年冬季、2017年春季、2017年夏季、2017年秋季和2017年冬季；将胎次划分为3个水平，分别为1胎、2胎和3胎及以上；将泌乳阶段划分为4个阶段，分别为1～100 d(阶段Ⅰ，泌乳前期)、101～200 d(阶段Ⅱ，泌乳中期)、201～305 d(阶段Ⅲ，泌乳后期)、306 d及以后(阶段Ⅳ，泌乳末期)；将挤奶状态划分3个水平，分别为挤奶前、挤奶后和未知。

本研究中，根据有表型个体的牛号，利用北京地区荷斯坦牛群体的大系谱追溯用于血浆PRL浓度性状遗传分析的小系谱，最终本研究所用的系谱文件中包含公牛699头和母牛2 531头。

1.4 统计分析

1.4.1血浆PRL浓度影响因素分析

使用SAS 9.2软件的MIXED过程，对可能影响血浆PRL浓度的非遗传因素进行方差分析，采用 Bonferronit检验进行多重比较，考虑的因素如模型1所示：

Yijklm=μ+TIMEi+LACTj+STAGEk+ADl+idijklm+eijklm

(1)

式中：Yijklm为血浆催乳素浓度，mIU/L；μ为总体均值；TIMEi为采样季节效应(i=1～7)；LACTj为胎次效应(j=1，2，3)；STAGEk为泌乳阶段效应(k=1～4)；ADl为挤奶前后效应(l=1，2，3)；idijklm是个体随机效应，eijklm为随机残差。

1.4.2血浆PRL浓度遗传分析

基于DMU软件的DMUAI程序，采用单性状重复力模型估计血浆催乳素浓度的方差组分和遗传力，保留1.4.1中显著的非遗传因素加入模型2，模型中包含的效应如下：

Yijkm=TIMEi+LACTj+STAGEk+peijkm+aijkm+eijkm

(2)

1.4.3血浆PRL浓度与基因PRL、PRLR和TRH关联分析

使用SAS 9.2 软件的MIXED过程，对血浆PRL浓度与基因PRL、PRLR和TRH的多态位点或单倍型进行关联分析，保留1.4.1中显著的非遗传因素加入模型3，采用 Bonferronit检验进行多重比较，模型中包含的效应如下：

Yijklm=μ+TIMEi+LACTj+STAGEk+SNPl+idijklm+eijkm

(3)

式中：Yijklm表示血浆催乳素浓度(mIU/L)；TIMEi、LACTj、STAGEk表示的效应同模型1；SNPl是基因型效应或单倍型组合效应；idijklm是个体随机效应，eijkm为随机残差。

2 结果与分析

2.1 非遗传因素对血浆PRL浓度的影响

血浆PRL浓度的描述性统计结果如表1所示。本研究中，血浆催乳素浓度最大为371.28 mIU/L，最小为112.9 mIU/L，平均浓度为224.29 mIU/L，变异系数为20.9%。

表1 泌乳期荷斯坦牛血浆催乳素浓度描述性统计Table 1 Descriptive statistics of plasma prolactin concentration in lactating Holstein cattle

采用模型1分析了采样季节、胎次、挤奶前后和泌乳阶段对奶牛血浆PRL浓度的影响，分析结果表明，采样季节和泌乳阶段对血浆中PRL浓度有极显著影响(P<0.01)，胎次对血浆PRL浓度有显著影响(P<0.05)，而挤奶前后对血浆PRL浓度无显著影响(P>0.05)，各效应不同水平最小二乘均值估计值及多重比较结果如表2所示。奶牛血浆PRL浓度随胎次升高而升高，3胎及以上奶牛的PRL浓度显著高于1胎，2个水平间相差11.1 mIU/L。在各个季节之间，奶牛PRL浓度表现出显著差异；2014年内，夏季的血浆PRL浓度最高，较冬季的PRL浓度高了85.67 mIU/L；2017年内，奶牛在春季的PRL浓度最高，夏季次之，2个季节均处于较高水平，秋季浓度最低，较春季低了64.23 mIU/L。随泌乳阶段逐渐升高，奶牛血浆PRL浓度也逐渐升高；其中，阶段Ⅰ(1～100 d)的PRL浓度显著低于阶段Ⅳ(泌乳天数在306 d及以后)，两阶段的血浆PRL浓度相差12.67 mIU/L。但在本研究中，奶牛在挤奶之前和挤奶之后的血浆PRL浓度无显著差异。

表2 非遗传因素对荷斯坦牛血浆催乳素浓度的影响Table 2 Effects of non-genetic Factors on plasma prolactin concentration of Holstein

2.2 血浆催乳素浓度遗传力估计

利用单性状重复力动物模型估计了血浆PRL浓度的遗传参数，血浆PRL浓度的方差组分和遗传参数如表3所示。由表3可知，荷斯坦牛血浆PRL浓度是一个低遗传力性状，其遗传力估计值为0.02±0.04，重复力估计值为0.06。

2.3 基因PRL、PRLR和TRH多态位点与血浆PRL浓度的关联分析

本研究共对15个SNP进行了母牛群体的分型，其中PRL基因4个，PRLR基因3个，TRH基因8个，各基因中SNP的rs号见表4。采用模型3分别对每个SNP与奶牛血浆PRL浓度进行了关联分析，每个SNP仅保留基因型频率高于0.03的基因型。结果显示，TRH基因的位点rs109144892、rs108991567、rs109468305及rs109330999与血浆催乳素浓度极显著相关(P<0.01)，TRH基因的rs137596325位点与血浆催乳素浓度显著相关(P<0.05)，其余10个SNP与血浆催乳素浓度无显著相关，各SNP不同基因型的血浆PRL浓度最小二乘均值估计值及多重比较结果如表4所示。

表3 荷斯坦牛血浆催乳素浓度方差组分及遗传参数Table 3 Genetic parameters and variance components of plasma prolactin concentration in Holstein

基因PRL中，位点rs108970792为TT基因型的血浆PRL浓度较同位点其他基因型更低，但差异未达到显著水平。基因TRH中， rs109144892位点为TT基因型个体的血浆PRL浓度极显著高于CT，高出7.02 mIU/L； rs108991567位点为CC基因型个体的血浆PRL浓度极显著高于TC，高6.91 mIU/L；rs109468305位点为TT基因型的血浆PRL浓度极显著高于CT，高7.04 mIU/L；rs109330999位点为AA基因型个体的血浆PRL浓度极显著高于TA，高6.95 mIU/L；rs137596325位点为AA基因型个体的血浆PRL浓度显著高于A-，高9.27 mIU/L；rs135342429位点为AA基因型个体的血浆PRL浓度较GG高5.22 mIU/L，但差异未达到显著水平。

表4 基因PRL、PRLR和TRH多态位点与血浆催乳素浓度的关联分析Table 4 Association analysis of PRL, PRLR, and TRH polymorphic loci with plasma prolactin concentration

表4(续)

2.4 基因PRL、PRLR和TRH单倍型与血浆PRL浓度的关联分析

使用Haploview 4.2软件，采用系谱推断法分别对基因PRL、PRLR和TRH的SNP进行连锁不平衡分析(图1)。本研究中，在基因PRL上确定了一个单倍型块，命名为PRL Block，由rs108970792、rs384170723、rs110684599和rs110586822组成；在基因PRLR上确定了1个单倍型块PRLR Block，由rs134638792和rs110971500组成；在基因TRH上确定了TRH Block1和TRH Block2 2个单倍型块，TRH Block1由 rs137596325和rs381314916组成，TRH Block2由rs109144892、rs42602973、rs108991567、rs109468305和rs109330999组成。各单倍型块中，单倍型的基因型及其频率如表5所示。

图1 PRL、PRLR和TRH基因的SNP连锁不平衡分析Fig.1 SNP linkage disequilibrium analysis of PRL, PRLR, and TRH genes

表5 基因PRL、PRLR和TRH单倍型的基因型及其频率Table 5 Genotype and frequency of haplotypes in gene PRL, PRLR and TRH

针对每个单倍型块，仅保留数据量大于50的单倍型组合用于关联分析，采用模型3对基因PRL、PRLR和TRH的4个单倍型块进行了与血浆PRL浓度的关联分析。结果显示，单倍型块PRL Block与血浆PRL浓度无显著相关，单倍型块PRLR Block与血浆PRL浓度具有显著关联的趋势(P=0.08)；单倍型块TRH Block1和TRH Block2均与血浆PRL浓度显著关联(P<0.05)，各单倍型块中不同单倍型组合的血浆PRL浓度的最小二乘均值及多重比较结果如表6所示。

基因PRLR中，单倍型H2H2的血浆PRL浓度最高，为251.97 mIU/L，较单倍型H2H3(241.87 mIU/L)高10.10 mIU/L。基因TRH的单倍型块TRH Block1中，H2H2的血浆PRL浓度最高，为251.28 mIU/L，较H1H2(241.66 mIU/L)和H1H3(241.13 mIU/L)分别高9.6和10.15 mIU/L；TRH Block2中，单倍型组合H2H2的血浆PRL浓度显著高于组合H1H2，高10.04 mIU/L。

3 讨 论

本研究发现，采样季节对奶牛血浆PRL浓度有极显著影响，在春季、夏季时奶牛血浆PRL浓度比秋冬季节更高，奶牛为抵抗春末和夏季的热应激增加了催乳素的分泌。在胡丽蓉等[9]的研究中，在热应激状态、非应激状态和冷应激状态下，奶牛血浆PRL水平有极显著差异，且热应激状态下血浆PRL浓度显著高于其他状态，这与本研究结果一致。本研究中，胎次和泌乳阶段对血浆PRL浓度有显著或极显著水平的影响，并随胎次和泌乳阶段的推移而逐渐升高。在韩英东等[10]的研究中，泌乳阶段对PRL无显著影响，胎次对泌乳牛血液PRL含量有显著的影响，但该研究2胎和3胎奶牛的血液PRL含量显著高于4胎奶牛，与本研究结果相反。值得注意的是，该研究采用放射免疫法测定了血液中PRL含量，且该研究的数据量小于本研究。

表6 基因PRL、PRLR和TRH单倍型块与奶牛血浆催乳素浓度的关联分析Table 6 Association analysis of PRL, PRLR and TRH haploblock with plasma prolactin concentration

本研究群体中，共发现了PRL基因的rs108970792、rs384170723、rs110684599和rs110586822等4个SNP。通过基因分型和关联分析，上述4个SNP与血浆PRL浓度均无显著相关。其中，rs384170723、rs110684599和rs110586822均位于PRL基因的上游区域，因此本研究推测这3个SNP对PRL基因的表达无明显调控作用。位点rs108970792位于外显子5，为同义突变，不改变氨基酸序列。本研究群体中，位点rs108970792的TT基因型的基因型频率仅为0.04，且该基因型个体的血浆PRL浓度比其他2种基因型更低。随着对同义突变的认识逐渐深入，发现同义突变会影响除了蛋白质序列外的很多生物学过程，比如转录因子的识别，mRNA的剪接、折叠和降解，以及蛋白质翻译的起始、效率和准确性等[22-24]。最新研究表明[25]，在酿酒酵母中，至少75%的同义突变会显著损害其适应度。同义突变导致生物对环境的适应能力下降可能也是rs108970792位点TT基因型个体在本研究群体中极少的原因。

在PRLR基因上，本研究群体中共发现rs135164815、rs134638792和rs110971500等3个SNP。上述3个位点与血浆PRL浓度均无显著关联。其中，rs135164815位点位于PRLR基因的第5外显子，为错义突变，会引起第18个氨基酸由丝氨酸变成天冬酰胺，本研究群体中仅有1头奶牛该位点为AG基因型。在芬兰爱尔夏牛群体中，该SNP位点会显著影响奶牛的产奶量、乳蛋白产量和乳脂产量[26]；此外，基因PRLR的变异与牛胚胎存活率、种公牛繁殖力显著相关[27-28]。考虑到催乳素在奶牛繁殖和泌乳中扮演的重要作用，我们猜测rs135164815位点突变可能会影响催乳素的分泌或信号传导，一方面影响奶牛产奶性能导致奶牛被人为淘汰，另一方面影响奶牛繁殖，造成突变个体适应能力降低。位点rs110971500位于PRLR第10外显子，为同义突变，本研究群体中该位点AA基因型的基因型频率仅为0.03。本研究还发现，由同义突变位点rs134638792和内含子突变位点rs110971500组成的单倍型块PRLR Block与血浆PRL浓度存在一定关联性，单倍型组合H2H2的血浆PRL浓度较H2H3高10.10 mIU/L，H2H2组合为位点rs108970792的CC基因型，H2H3组合则是该位点的CA基因型，说明rs108970792突变与催乳素的分泌有一定关系。

在TRH基因上，本研究共发现rs135342429、rs137596325、rs381314916、rs109144892、rs42602973、rs108991567、rs109468305和rs109330999等8个SNP。位点rs137596325与血浆PRL浓度显著相关，且AA基因型个体的PRL浓度最高。rs381314916位点位于TRH基因外显子2上的5’UTR，与血浆PRL浓度无显著相关，本研究群体中该位点的CC基因型的基因型频率仅为0.04。连锁不平衡分析中，rs137596325和rs381314916位点共同组成了TRH Block1，并与血浆PRL浓度显著相关，单倍型组合H2H2个体的PRL浓度最高，H1H1次之，H2H2和H1H1组合中均包含位点rs137596325的AA基因型。TRH基因的位点rs109144892、rs108991567、rs109468305和rs109330999与血浆PRL浓度极显著相关，其PRL浓度最高的基因型分别为TT、CC、TT和AA，上述4个位点与 rs42602973共同组成了单倍型块TRH Block2，TRH Block2与血浆PRL浓度显著相关，单倍型H2H2个体的血浆PRL浓度最高，H2H3次之；而H2H2、H2H3正是位点rs109144892、rs108991567、rs109468305和rs109330999血浆PRL浓度最高的基因型与位点rs42602973上2个高频基因型的组合，单位点关联分析和单倍型组合关联分析相互佐证。有研究表明，促甲状腺激素释放激素对催乳素的分泌起着重要调控作用[15]，泌乳牛注射TRH的活体试验[16]和体外培养的细胞试验[17]也证明了该结论。上述各位点中，rs109144892、rs108991567、rs109468305和rs109330999位于TRH基因上游，rs137596325位点位于TRH基因下游，已有研究表明[29-30]，基因上下游的序列可能存在与基因表达调控有关的调控元件，具有增强或减弱转录活性的作用。由此可以推断，基因TRH中位点rs137596325、rs109144892、rs108991567、rs109468305和rs109330999的突变可能通过影响TRH的分泌，进而调节奶牛催乳素的分泌。

4 结 论

本研究发现，泌乳期荷斯坦牛的血浆催乳素(PRL)浓度是一个低遗传力性状，受采样季节、胎次和泌乳阶段的显著影响。基因PRL和PRLR中未发现与血浆PRL浓度显著相关的SNP；TRH基因的位点rs109144892、rs108991567、rs109468305、rs109330999和rs137596325与血浆PRL浓度显著相关。单倍型关联分析发现，基因PRLR上的单倍型块与血浆PRL浓度有一定关联性，基因TRH上的2个单倍型块与奶牛血浆PRL浓度显著相关。本研究通过系统的遗传学分析获得了荷斯坦牛血浆PRL浓度的群体特征和遗传参数，探究了与血浆PRL浓度分泌相关基因的多态性及其与血浆PRL浓度的关联情况，为研究奶牛血浆PRL浓度的遗传基础提供参考。