‘陇薯8号’马铃薯块茎淀粉积累特性及淀粉-蔗糖代谢途径转录组分析

贾小霞 李建武 齐恩芳 文国宏 李高峰 吕和平 马 胜 刘 石 黄 伟 张 荣

(1.甘肃省农业科学院 马铃薯研究所/甘肃省马铃薯种质资源创新工程实验室，兰州 730070； 2.国家种质资源渭源观测实验站，甘肃 渭源 748201)

淀粉是人类最重要的膳食能量来源，占每日热量摄入总量的80%，因此在食品工业中起着至关重要的作用[1-3]，同时也是许多工业应用的原料，全球每年工业对淀粉的需求量为1.8亿t[4]。与其他谷类作物淀粉粒相比，马铃薯淀粉粒较大，且高度磷酸化，这不仅增加了淀粉溶液的粘度，且赋予了其微弱阴离子、高膨胀力和糊化温度低等特性[5]，被广泛应用于食品、医药、纺织、造纸、化学等各个领域[6]。淀粉作为马铃薯块茎中重要的储能物质，占块茎鲜重的10%～25%，占块茎干物质的60%～80%[7]，很大程度上影响着马铃薯鲜食和加工品质的优劣，因此，选育高淀粉马铃薯新品种具有重要意义。甘肃省农业科学院马铃薯研究所选育的中晚熟马铃薯新品种‘陇薯8号’平均淀粉含量稳定在22.91 g/100 g以上，超过了国内高淀粉品种标准18 g/100 g，属超高淀粉型[6,8]，分析其淀粉积累规律及其淀粉合成代谢相关基因的表达模式，了解其淀粉合成特点，可为马铃薯淀粉相关基因的鉴定、功能分析以及高淀粉含量的新品种选育提供参考。淀粉的合成受蔗糖合酶(Sucrose synthase，Susy)、UGP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)、磷酸葡萄糖变位酶(Phosphoglucomutase，PGM)、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophsphorylase，AGPase)和淀粉合酶(Starch synthase，SS)等多种酶的协同催化[9]，受编码多种酶基因表达的影响[10-11]。关于马铃薯块茎淀粉合成相关基因的研究多集中在通过抑制[12-13]或过量表达[14-15]方式干预淀粉含量及其组分的合成以及部分关键基因在不同品种中的表达分析等方面[16]。马铃薯栽培种是高度杂合的同源四倍体，遗传背景十分复杂，借助分子生物学方法逐一地研究淀粉合成代谢相关的大量基因，难度大、效率低。高通量转录组测序(RNA-Seq)技术能够全面快速获取特定器官或组织在特定状态下的几乎所有转录本[17]，可系统分析马铃薯块茎在不同生长发育时期的基因调控网络。石瑛等[18]应用RNA-Seq技术研究了‘东农310’马铃薯块茎不同发育时期的基因转录情况，并对各时期表达差异显著的基因进行了功能注释。目前，结合淀粉积累规律高通量分析马铃薯淀粉合成代谢相关基因表达模式的研究鲜见报道。因此，本研究通过对超高淀粉马铃薯品种 ‘陇薯8号’不同发育时期的块茎进行蔗糖和淀粉含量测定以及RNA-Seq，旨在分析‘陇薯8号’淀粉积累规律及其淀粉合成代谢相关基因的表达模式，以期为马铃薯淀粉合成相关基因的鉴定、功能分析以及‘陇薯8号’在马铃薯育种研究中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试马铃薯品种‘陇薯8号’和‘陇薯13号’由甘肃省农业科学院马铃薯研究所提供。试验用原种于2020年4月中旬种植于渭源县会川镇甘肃省农业科学院马铃薯育种基地(35°03′ N，104°04′ E，海拔2 240 m，年平均气温5.7 ℃，降雨量560 mm，无霜期130 d左右)，露地平播种植，按照常规管理方式进行田间管理。对同时处于盛花期的植株进行标记并采样，样本记为T1，之后每15 d采一次样，共采5次，分别记为T2、T3、T4和T5。每个时期分别采集块茎样本，设3次生物学重复，每个重复选3株长势一致的植株，每株取2个块茎，每个块茎分别取其顶部、中部、底部3片厚度为0.5 cm的薄片，然后切成均匀一致的小颗粒，等重量充分混合，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2 淀粉含量测定

将‘陇薯8号’块茎样本在冷冻干燥机(ALPHA1-2LD plus)冷冻干燥后，在研钵中研磨成细粉，用30目筛子过滤后，使用分光光度计(UV-2102C)，利用梦犀生物医药科技有限公司生产的植物淀粉测定试剂盒，通过双波长光谱测定淀粉含量，每个发育阶段3个生物学重复。

1.3 蔗糖含量测定

利用梦犀生物医药科技有限公司生产的蔗糖含量测定试剂盒，按照试剂盒说明书测定‘陇薯8号’块茎蔗糖含量。

1.4 转录组测序

采集‘陇薯8号’T1、T2、T3、T4和T5的块茎样本，每时期设3个生物学重复，分别记为T1-1、T1-2、T1-3，T2-1、T2-2、T2-3，T3-1、T3-2、T3-3，T4-1、T4-2、T4-3，T5-1、T5-2、T5-3，按1.1的方法取样后，委托北京百迈客生物信息科技有限公司借助Illumina HiSeq Xten平台进行高通量转录组测序。

1.5 差异表达基因的筛选、功能注释和富集分析

测序得到的原始数据(Raw data)，过滤掉含有接头和低质量的数据后，得到Clean reads，将Clean data与马铃薯参考基因组(http:∥solanaceae.plantbiology.msu.edu/dm_v6_1_download.shtml)进行比对。根据FPKM (Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments)值法计算每个基因在5个时期15个样本中的表达量，利用DESeq2_EBSeq软件进行分析，找出不同样本之间差异表达的基因(FDR<0.01且|Fold Change|≥2)，将Unigene在相应的数据库(Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG)中进行序列比对，获得注释信息。分别利用topGO[19]和KOBAS[20]软件对差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)进行富集分析。

1.6 qRT-PCR分析

为验证RNA-Seq结果的可靠性，从DEG中随机选取4个基因(Soltu.DM.01G049590、Soltu.DM.07G001730、Soltu.DM.08G001120和Soltu.DM.02G027020)，以马铃薯EF1α基因为内参，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分别检测各基因在‘陇薯8号’T1、T2、T3、T4和T5中的表达量。为验证Soltu.DM.09G031820、Soltu.DM.07G013370、Soltu.DM.01G049590和Soltu.DM.02G027020在淀粉含量不同的马铃薯品种中的表达水平，选择中晚熟(生育期120 d左右)低淀粉含量(16.27 g/100 g)品种‘陇薯13号’[21]T2和T5时期块茎样本和‘陇薯8号’相应时期的块茎样本，提取总RNA并进行反转录，以转录的cDNA为模板，根据目标基因序列设计特异性引物(表1)，按照 SYBR Premix ExTaq(TaKaRa)反应体系，用ABIPRISMR 7300 实时荧光定量PCR仪(ABI，USA)进行qRT-PCR扩增，反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，45个循环。采用2-ΔΔCT法计算各目的基因的相对表达量[22]。

1.7 统计分析

原始数据用Microsoft Excel 2010 软件整理后，运用DPS V3.01软件进行单因素方差(One-way analysis, ANOVA)统计分析，所有数据均为“各重复的平均值±标准误”。

2 结果与分析

2.1 块茎发育过程中蔗糖和淀粉动态变化规律

由图1可知，在整个取样期内，蔗糖含量在T1—T3显著降低，T3达到最小值;T3—T4有所回升，且T4显著高于T3;T4—T5略有降低，但二者差异不显著。淀粉含量随生育进程的推进逐渐增加，其中T1—T3显著增加，且T2—T3为激剧增长期，T3—T5持续增加，但各时期差异不显著。

2.2 测序质量评估和差异基因筛选

15个马铃薯样本经建库和测序，样本的有效读段数介于39 753 860—84 087 718，单一匹配率均在75% 以上，Q30也都在92%以上，说明RNA-Seq数据质量较好，测序数据可靠度高(表2)。

对15个转录组样本数据进行参考基因组比对分析，共获得14 634个基因的转录表达数据，经筛选得到各相邻时期的差异表达基因(图2)。T1vs T2差异表达基因总数为1 279，其中535上调，744下调；T2vs T3差异表达基因总数为427，其中224上调，203下调；T3vs T4差异表达基因总数为184，其中132上调，52下调；T4vs T5差异表达基因总数为300，其中157上调，143下调。

表1 用于qRT-PCR分析的基因及其引物Table 1 Genes and primers for analysis of qRT-PCR

T1、T2、T3、T4和T5代表从盛花期开始，每隔15 d取样1次，共5次。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。 T1, T2, T3, T4 and T5 represent the five samples collected from the full flowering stage, and the samples were collected every 15 d. Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level. The same below.图1 块茎发育过程中蔗糖(a)和淀粉(b)含量动态变化Fig.1 Dynamic changes of sucrose (a) and starch (b) contents during tuber development

表2 RNA-seq数据总览Table 2 Overview of RNA-seq data

红、绿、黑色点分别代表显著上、下调和表达量未发生变化的基因。 The red, green and black dots in theFigure represent significantly up-regulated, down-regulated and unchanged genes, respectively.图2 差异表达基因火山图Fig.2 Volcano plot of differentially expressed genes

2.3 淀粉-蔗糖代谢途径差异表达基因筛选

由表3可知，T1vs T2差异表达基因最多，共16个(图3)，其次是T2vs T3和T3vs T4，分别为8和6个，T4vs T5最少，只有4个。各相邻时期的特有差异基因和各组间共有差异基因的总数为24个，其中4个注释为蔗糖合酶(Sucrose synthase，EC:2.4.1.13)，3个注释为葡聚糖内切1,3-β-葡萄糖苷酶(Glucan endo-1,3-beta-glucosidase，EC:3.2.1.39)，注释为腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-Glucose pyrophosphorylase，EC:2.7.7.27)、β-淀粉酶(beta-amylase，EC:3.2.1.2)、海藻糖6-磷酸合酶/磷酸酶(trehalose 6-phosphate synthase/phosphatase，EC:2.4.1.15 3.1.3.12)和胞外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 1/3，EC:3.1.4.1 3.6.1.9)各2个，注释为淀粉合酶(starch synthase，EC:2.4.1.21)、葡聚糖1,3-β-葡萄糖苷酶(glucan 1,3-beta-glucosidase，EC:3.2.1.58)、β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase，EC:3.2.1.21)、内切葡聚糖酶(endoglucanase，EC:3.2.1.4)、糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase，EC:2.4.1.1)、果糖激酶(fructokinase，EC:2.7.1.4)、海藻糖6-磷酸磷酸酶(trehalose 6-phosphate phosphatase，EC:3.1.3.12)、6-磷酸葡萄糖异构酶(glucose-6-phosphate isomerase，EC:5.3.1.9)和β-呋喃果糖苷酶(beta-fructofuranosidase，EC:3.2.1.26)各1个。

表3 各对照组差异表达基因注释信息和log2(fold change)值Table 3 Annotation information and log2 (fold change) value of differentially expressed genes in each comparison group

红色和绿色框分别代表上、下调差异表达基因；3.2.1.39：葡聚糖内切1,3-β-葡萄糖苷酶；3.2.1.58：葡聚糖1,3-β-葡萄糖苷酶；3.2.1.21：β-葡萄糖苷酶；3.2.1.4：内切葡聚糖酶；5.3.1.9：6-磷酸葡萄糖异构酶；2.4.1.13：蔗糖合酶；3.6.1.9：胞外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员；2.7.7.27：腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶；2.4.1.21：淀粉合酶；2.4.1.15：海藻糖6-磷酸合酶/磷酸酶；3.1.3.12：海藻糖6-磷酸磷酸酶；3.2.1.2：β-淀粉酶。 The red and green boxes respectively represent up and down-regulated differentially expressed genes; 3.2.1.39: Glucan endo-1,3-beta-glucosidase; 3.2.1.58: Glucan 1,3-beta-glucosidase; 3.2.1.21: Beta-glucosidase; 3.2.1.4: Endoglucanase；5.3.1.9: Glucose-6-phosphate isomerase; 2.4.1.13: Sucrose synthase; 3.6.1.9: Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 1/3; 2.7.7.27: ADP-Glucose pyrophosphorylase; 2.4.1.21: Starch synthase; 2.4.1.15: Trehalose 6-phosphate synthase/phosphatase; 3.1.3.12: Trehalose 6-phosphate phosphatase; 3.2.1.2: Beta-amylase.图3 淀粉-蔗糖代谢途径(T1 vs T2)Fig.3 Starch-sucrose metabolic pathway (T1 vs T2)

2.4 淀粉-蔗糖代谢途径差异基因表达分析

由表4可知，蔗糖合酶基因Soltu.DM.09G031820和Soltu.DM.07G013370、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因Soltu.DM.01G049590、淀粉合酶基因Soltu.DM.02G027020和糖原磷酸化酶基因Soltu.DM.03G007710在各时期表达量不尽相同，且除Soltu.DM.09G031820在T1的表达水平低于Soltu.DM.09G021500外,这5个基因在各时期的表达量均高于同期其他基因。

2.5 qRT-PCR验证

分别对Soltu.DM.08G001120、Soltu.DM.07G001730、Soltu.DM.02G027020和Soltu.DM.01G049590基因在5个样本中的表达量进行qRT-PCR验证，并与RNA-seq数据以T1vs T2、T2vs T3、T3vs T4、T4vs T5进行比较分析。如图4所示，2种方法分析后各基因的相对表达量虽不完全相同，但表达变化趋势一致，说明RNA-seq测序数据具有较高的可重复性和准确性。

2.6 不同淀粉含量马铃薯品种中基因表达分析

由图5可以看出，Soltu.DM.02G027020、Soltu.DM.07G013370、Soltu.DM.09G031820和Soltu.DM.01G049590四个基因在T2和T5时期的‘陇薯8号’块茎中的表达量都高于‘陇薯13号’，其中除Soltu.DM.02G027020和Soltu.DM.09G031820基因分别在T2和T5时期的表达量在两品种间差异不显著外，各基因在其余时期的差异都达到显著水平。

表4 不同基因在不同时期块茎中的FPKMTable 4 FPKM value of different genes in different periods potato tubers

3 讨 论

淀粉作为马铃薯块茎最主要的碳水化合物，主要由蔗糖转化而成，其合成和积累涉及复杂的生理生化过程，需要多种酶协同催化[23]，受编码多种酶基因表达的影响[10-11]。‘陇薯8号’块茎淀粉含量随发育进程的推进逐渐增加，且前期淀粉积累速率远超后期；蔗糖含量与淀粉含量的变化趋势刚好相反(图1)；4个相邻时期比较组T1vs T2、T2vs T3、T3vs T4和T4vs T5的差异表达基因总数逐渐减少，总体上反映了‘陇薯8号’块茎发育前期在分子功能、细胞代谢和生物过程等方面都比较活跃。

糖转运蛋白(Sugar transporters，STs)在植物生长发育过程中发挥着重要作用，主要介导糖类物质的运转，参与源和库组织之间的碳水化合物的装载和卸出[24-25]。蔗糖合成淀粉的过程发生在造粉体中，叶片中由光合作用合成的蔗糖通过韧皮部转移至胞质中，然后在相关酶的作用下合成淀粉[26]，淀粉合成相关酶基因表达量的提高可能促进了造粉体中微管结构的增加，从而促进了造粉体中淀粉粒的形成与积累，最终提高了成熟籽粒中的淀粉含量[27]。本研究筛选出各时期差异表达的糖转运蛋白基因3个(Soltu.DM.01G039610、Soltu.DM.04G035490和Soltu.DM.01G023330)，其中只有Soltu.DM.04G035490在整个取样期高水平表达，其他2个基因表达量很低，推测Soltu.DM.04G035490在蔗糖的运输中发挥重要作用。淀粉-蔗糖代谢途径的上调表达基因数目和差异倍数在各相邻时期的比较组间不尽相同，这意味着块茎不同发育时期淀粉-蔗糖代谢途径各基因的表达存在差异，可能正是因为这种差异才促成马铃薯块茎的形态建成和淀粉的合成与积累。为了进一步掌握各基因的具体表达水平，对24个差异表达基因在5个时期的FPKM值进行了统计分析，发现虽然各基因在不同相邻时期的表达量差异显著，但除蔗糖合酶基因Soltu.DM.09G031820和Soltu.DM.07G013370、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因Soltu.DM.01G049590、淀粉合酶基因Soltu.DM.02G027020和糖原磷酸化酶基因Soltu.DM.03G007710在整个取样期都高水平表达(FPKM较大)外，其他基因表达量极低。蔗糖合酶是植物蔗糖代谢途径中非常重要的酶，它能可逆的催化UDPG+FructoseSucrose+UDP反应，既能催化蔗糖的合成，也能分解蔗糖，但通常认为它的主要作用是分解蔗糖[28]。蔗糖合酶也是蔗糖转化为淀粉的关键酶，首先催化蔗糖转化为尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)，UDPG在UGP-葡萄糖焦磷酸化酶的作用下转化成淀粉合成底物葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)[29-31]。本研究在整个取样期内，2个蔗糖合酶基因Soltu.DM.09G031820和Soltu.DM.07G013370持续高水平表达，蔗糖含量显著降低后有所回升，而淀粉含量持续增加，因此，推测Soltu.DM.09G031820和Soltu.DM.07G013370可能作为重要的调控基因，通过高水平表达调控蔗糖向淀粉的转化过程，后期蔗糖含量有所回升，可能由蔗糖合成与分解之间的动态平衡导致。腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)是一种异形四聚体，马铃薯AGPase由2个大亚基(调节亚基)和2个小亚基(催化亚基)组成[32]，是淀粉生物合成途径的主要调控位点和淀粉合成过程中的限速酶[33]，催化G-1-P转变为淀粉合成的直接底物腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG)[34-35]，ADPG中的葡萄糖基在淀粉合成酶的作用下转移到α-1,4-葡萄糖的非还原性末端上，从而催化淀粉的合成。在马铃薯块茎的淀粉合成过程中，AGPase主要在转录水平上对淀粉合成进行调控，其表达水平的高低对淀粉积累和组成具有决定性作用[36]。超量表达AGPase小亚基基因sAGP，AGPase酶活性增强、淀粉含量升高，抑制表达sAGP，则AGPase酶活性下降、淀粉含量降低[14]。

图4 RNA-Seq数据的qRT-PCR验证Fig.4 Validation of RNA-Seq data by qRT-PCR

图5 不同淀粉含量马铃薯品种中4个淀粉-蔗糖代谢途径基因表达分析Fig.5 Expression analysis of 4 genes in starch-sucrose metabolic pathway of 2 potato varieties with different starch content

4 结 论

‘陇薯8号’块茎淀粉含量在整个取样期随发育进程的推进逐渐增加，且前期急剧积累，后期积累量增加趋于平缓；蔗糖含量与淀粉含量的变化趋势刚好相反。蔗糖合酶基因Soltu.DM.09G031820和Soltu.DM.07G013370、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因Soltu.DM.01G049590和淀粉合酶基因Soltu.DM.02G027020在‘陇薯8号’的整个取样期均高水平表达，与淀粉含量的不断增加相吻合，并且在低淀粉品种‘陇薯13号’中的表达水平相对较低。因此，推测Soltu.DM.09G031820、Soltu.DM.07G013370、Soltu.DM.01G049590和Soltu.DM.02G027020可能在‘陇薯8号’块茎的淀粉合成与积累中起重要的调控作用。