组蛋白去乙酰化酶抑制剂对呼吸道合胞病毒感染诱发的气道炎性反应作用机制

冯秋琴，黄 欢，杨 眉，田 曼

(1.珠海市妇幼保健院，广东 珠海 519000；2.南京市儿童医院呼吸内科 南京 医科大学，江苏 南京 210008)

呼吸道合胞病毒(RSV)是毛细支气管炎和肺炎的主要原因，除了直接损伤上皮细胞，RSV病毒感染患儿和免疫缺陷患者通常会有严重的呼吸道炎性反应[1]，包括促炎因子分泌、支气管和血管中炎性反应细胞增加和黏液生成。针对RSV感染，诊断干预措施对临床结局的影响不大，除了支持措施，如氧疗、对症支持外，国内外还没有具体的药物治疗方法。因此，毛细支气管炎是一个临床难题，是临床及研究人员面临的重大挑战。

蛋白质乙酰化是一种重要的表观遗传修饰模式，在宿主防御病毒感染中起着关键作用。组蛋白去乙酰化酶(HDAC)是从组蛋白上的特定赖氨酸残基去除乙酰基部分以调节染色质结构和基因表达的酶，通过调节蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质-DNA相互作用的变化，起到控制不同的细胞功能的作用[2]。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)被证实在很多疾病中有抑制疾病发展的作用，HDACi起初因作为抗癌药物的潜在用途而受到关注，研究发现HDACi类药物曲古抑菌素A(TSA)对对乳腺癌细胞株增殖周期起到抑制作用[3-4]。TSA可能是调节呼吸道RSV诱导的毛细支气管炎的一种新的治疗方法，为临床新治疗手段提供基础研究依据。除具有抗癌活性外，HDAC抑制剂被发现还具有有效的抗炎特性，如TSA可以抑制甲肝病毒的复制从而降低丙肝感染风险[5]，其治疗效果还在脓毒性休克、类风湿关节炎、多发性硬化和哮喘等炎性疾病中得到证实[6-8]。而HDACi在调节呼吸道疾病中的研究除了哮喘以外其余疾病研究很少。

本研究经过本院医学伦理委员会同意，旨在从细胞水平探索HDACi代表药物TSA在RSV复制中的功能，并确定TSA对RSV病毒炎性反应的影响及对氧化应激的影响。

1 资料与方法

1.1实验材料：化学品和材料：人支气管上皮细胞系BEAS-2B购自American Type Culture Collection(ATCC；Rockville，MD，USA)；药品TSA、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)购自St.Louis，MO，USA；细胞DMEM培养基和胎牛血清购自Carlsbad，CA，USA；白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购自Shanghai Ex Cell Biology Inc(中国上海)；丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)ELISA试剂盒购自 Jiancheng Bioengineering Institute(中国南京)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养、RSV病毒处理和药物毒力检测：人支气管上皮细胞系BEAS-2B在补充有胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM培养基中进行培养[9]。根据实验设计，将BEAS-2B细胞以适当的密度铺板用于体外细胞实验，并在实验前细胞生长36 h，后使用各种剂量[感染复数(MOI= 5、1、0.5、0.1、0.01)]RSV进行感染处理，再将指定浓度的TSA加入培养的BEAS-2B中，以确定TSA对细胞活力的影响，进行细胞活力测定的目的是确定药物TSA对培养的气道上皮细胞的潜在毒性作用。可见用500 nmol/L TSA处理BEAS-2B细胞不影响细胞生长活力，表明TSA抗病毒作用不是由于细胞毒性作用。

1.2.2Western印迹检测RSV作用后的BEASE-2B细胞HDAC2水平变化：体外培养人支气管上皮细胞系BEAS-2B细胞，在实验前细胞生长36 h，本次实验设计为对照组和不同剂量RSV处理组，用不同剂量的RSV(MOI=5、1、0.5、0.1、0.01)感染BEAS-2B细胞，并通过蛋白质印迹分析评估各组HDAC2的表达水平。

1.2.3Western印迹检测TSA作用RSV感染后的BEASE-2B细胞乙酰化组蛋白(Ac-H3)水平变化：体外培养人支气管上皮细胞系BEAS-2B，在实验前细胞生长36 h，本次实验设计为对照组、TSA处理组、RSV处理组、药物TSA+RSV病毒处理组，首先运用Western印迹检测不同剂量RSV病毒高剂量[(MOI=1)或低剂量(MOI= 0.1)]对细胞乙酰化组蛋白表达的影响，后用TSA处理RSV感染的BEAS-2B细胞[高剂量(MOI=1)或低剂量(MOI=0.1)]，24 h后运用蛋白印迹方法检测药物TSA加入后对RSV感染诱导的Ac-H3的表达水平。

1.2.4聚合酶链反应(q-PCR)技术检测HDACi两种代表药物TSA/SAHA对RSV病毒复制的影响：体外培养BEASE-2B细胞，将BEAS-2B细胞与500 nmol/L TSA或SAHA预孵育，RSV浓度MOI设置为0.5，处理24 h，通过q-PCR技术方法测定RSV病毒复制水平。

1.2.5ELISA检测炎性因子、氧化应激因子水平：体外培养人支气管上皮细胞系BEAS-2B，在实验前细胞生长36 h，用500 nmol/L TSA处理BEAS-2B细胞，并用各种剂量的RSV(MOI = 0.1或1)感染BEAS-2B，在感染后24 h收获细胞上清液，通过ELISA测量IL-6和IL-8的产生。同时使用特定试剂盒测量氧化应激相关分子(MDA与NO)释放。

2 结果

2.1RSV感染通过影响HDAC2表达改变组蛋白乙酰化水平:RSV感染的BEAS-2B细胞以MOI依赖性方式导致HDAC2的表达增加(见图1)。为了分析RSV感染诱导异常HDAC2表达是否是直接改变的组蛋白乙酰化过程，将TSA用于RSV感染的气道上皮细胞(AEC)，结果显示，用500 nmol/L TSA处理RSV感染的气道上皮细胞导致HDAC2表达显著降低，其与组蛋白H3乙酰化水平呈反相关关系(见图2)。该结果表明RSV诱导的气道上皮细胞中的组蛋白乙酰化异常是通过改变HDAC2的表达，并且这种作用被去乙酰化酶抑制剂TSA逆转。

图1 RSV感染通过影响HDAC2表达改变组蛋白乙酰化水平

图2 TSA处理RSV感染的BEAS-2B细胞测定Ac-H3表达

2.2HDACi可抑制RSV复制:实验结果显示，用TSA及SAHA处理RSV感染的BEAS-2B细胞病毒复制水平分别为(3.62±1.22)PFO/ml和(3.40±1.03)PFO/ml，较未干预BEAS-2B细胞病毒复制水平[(4.65±1.02)PFO/ml]明显降低，表明均可显著抑制RSV感染，表明HDACi可抑制RSV复制。

2.3用HDACi处理BEAS-2B细胞降低RSV诱导的炎性细胞因子释放和氧化应激水平:RSV感染气道上皮细胞24 h后IL-6和IL-8释放增加，而运用TSA预处理的组BEAS-2B细胞的细胞培养物上清液中的IL-6和IL-8产生明显减少(见表1)。另外，结果显示RSV感染会诱导氧化应激分子NO和MDA的释放，用HDACi类药物TSA处理减轻这一损伤(见表2)。表明TSA可以抑制RSV诱导的气道上皮细胞中炎性细胞因子的释放和氧化应激损伤。

表1 ELISA测量IL-6、IL-8释放水平

表2 测定氧化应激相关分子(MDA、NO)水平

3 讨论

尽管进行了深入研究，RSV感染的病理机制仍不清楚。其中一个关键点是RSV感染后出现不同临床症状的个体，有些人只有轻微的上呼吸道感染症状，不需要特殊治疗，而在另一些人中，RSV感染可能导致更严重的疾病，包括毛细支气管炎或肺炎，这些疾病可能致命，需要住院治疗[10]。

HDAC在基因表达调控中起着至关重要的作用，因为它通过乙酰化和去乙酰化组蛋白来调节染色质结构，作为组蛋白乙酰化的主要调节剂，HDAC是转录和表观遗传调节的关键因子，之前研究证实组蛋白乙酰化控制某些病毒感染[11]。在感染人类的诸多病原体中，HDAC与病毒复制和发病有关，包括疱疹病毒、人乳头瘤病毒、柯萨奇病毒、乙型肝炎、丙肝病毒(HCV)和人类免疫缺陷病毒HIV-1[12]。如在HCV感染期间，HDACi SAHA通过改变宿主细胞中基因(如OPN和Apo-A1)的表达而对HCV复制发挥抑制作用。在本研究中，目的是确定组蛋白乙酰化是否在RSV复制和病毒诱导的气道炎性反应的调节中起作用。

研究发现HDAC2对于肺部气道炎性反应的发展起着至关重要的作用。HDAC2的异常表达介导了哮喘或慢性阻塞性肺病(COPD)患者甾体抗性作用[13]。鉴于严重的RSV感染诱发的毛细支气管炎、哮喘和COPD存在密切关系，本文首先分析RSV感染对HDAC2表达的影响，证明了RSV引起HDAC2表达增加，并且RSV感染后组蛋白H3乙酰化被下调，用TSA治疗RSV感染的气道上皮细胞完全逆转了这些作用。同时，研究发现气道上皮细胞AEC暴露于TSA预处理后，观察到RSV病毒复制明显减少。总之，这些发现表明RSV对HDAC2表达的上调可能是促进病毒复制的重要机制，而组蛋白乙酰化的增强水平可以抑制病毒复制。

HDAC抑制剂在体外和体内研究发现具有发挥抗炎的作用。本研究发现使用TSA或SAHA可显著减轻RSV诱导的促炎细胞因子的产生，包括IL-6和IL-8。另外，氧化应激相关因子可能由气道上皮细胞AEC和气道内皮细胞产生，参与多种形式的组织损伤，包括对脂质、蛋白质和DNA等细胞成分的损害[14]。有研究发现，RSV感染可以诱导AEC活性氧(ROS)的产生[15]，抗氧化酶的表达和活性降低可能有助于减轻这种损伤。在本研究中，RSV感染的AEC中NO、MDA产生明显增加，说明抑制氧化应激作用也是HDACi类药物在RSV感染过程中发挥的作用机制之一。

从本研究中可进一步从细胞实验延伸到动物实验甚至是临床患者相关实验，进一步明确和验证去乙酰化酶抑制剂HDACi在RSV诱导的气道炎性反应中的作用机制，为HDACi类药物将来进入临床治疗呼吸道疾病提供重要的基础实验依据。