胰腺癌患者锌指蛋白772基因启动子区DNA甲基化的特征分析

郭文博

(佳木斯市中心医院普外一科,黑龙江 佳木斯 154002)

胰腺癌具有发病迅速、预后差、死亡率高等特点[1]。特别是胰腺血供丰富，又无包膜，发病早期就容易转移至胰周淋巴结，甚至转移到肝和肺等组织器官[2]。胰腺癌的早期诊断比较困难，很多患者在确诊时已处于中晚期，伴随有淋巴结转移或者远处转移，5年生存率低于10%，为此探索胰腺癌的发病机制具有重要价值[3]。现代研究表明胰腺癌的发生与发展涉及癌脱离原发病灶、躲避免疫监视、通过淋巴和血管迁移锚定生长等病理过程，也是一个多基因参与、多步骤完成的过程[4]。DNA甲基化作为恶性肿瘤发生的早期事件，是当前胰腺癌研究的热点，DNA异常甲基化可导致抑癌基因失活[5]。ZNF是具有锌指结构的转录因子，ZNF772是ZNF家族的一个成员[6]。ZNF772表达异常可导致下游Wnt/β-catenin信号通路的异常激活，从而促进恶性肿瘤的增殖与转移[7]。ZNF772基因启动子区DNA甲基化可能是ZNF772表达下调的重要原因之一，但是其调节的机制还需要进一步分析[8]。本文具体探讨了胰腺癌患者ZNF772基因启动子区DNA甲基化的特征，希望能为明确胰腺癌的发生提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料：2018年2月～2021年1月选择在佳木斯市中心医院诊治的胰腺癌患者118例为胰腺癌组，同期选择胰腺炎患者118例为胰腺炎组。纳入标准：两组分别符合胰腺癌、胰腺炎的诊断标准(经病理确诊)；年龄20～80岁；研究得到医院伦理委员会的批准；均具有病理取样的指征；Karnofsky评分(KPS)≥60分；病灶要求为原发病灶；病理检查前未行任何其他治疗。排除标准：妊娠与哺乳期妇女；有严重的未控制的内科疾病或急性感染者；合并其他创伤和肿瘤病史患者；无法得到病理证实的胰腺病变患者。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。在胰腺癌患者中，临床分期Ⅰ期68例，Ⅱ期32例，Ⅲ期18例；组织学分化：高分化58例，中分化32例，低分化28例；淋巴结转移45例，远处转移32例。

表1 两组一般资料比较

1.2ZNF772基因启动子区DNA甲基化的检测：取所有患者的胰腺病理组织，采用DNA抽提Kit试剂盒(QIAGEN公司)提取DNA，紫外分光光度计测吸光度值，确保提取的DNA质量合格。采用PCR检测ZNF772基因启动子区表达水平，PCR 产物长度为352 bp，上游序列为5′-TATGAGGCGTTAGAAAGTGTTT-3′，下游序列为5′-AATCAACTTTACCGGAAAACCCA-3′，同时使用GAPDH引物进行内参的扩增。扩增反应条件：95℃30 s、55℃30 s、72℃45 s，35个循环，最后72℃延伸5 min。将PCR产物送至大连TAKARA公司进行序列测序，主要判断CpG 位点是否发生甲基化，TG判为非甲基化，CG序列判为甲基化。

1.3调查资料：调查患者的性别、年龄、BMI、收缩压、舒张压、心率等一般资料，记录胰腺癌患者的临床分期、组织学分化、淋巴结转移、远处转移等资料。

2 结果

2.1ZNF772基因相对表达水平比较：胰腺癌组的ZNF772基因相对表达水平(0.88±0.11)，低于胰腺炎组的(2.47±0.18)，差异有统计学意义(t=9.193，P=0.001)。

2.2ZNF772基因启动子区DNA甲基化率比较：胰腺癌组的ZNF772基因启动子区DNA甲基化率为22例(18.6%)，高于胰腺炎组的2例(1.7%)，差异有统计学意义(χ2=18.553，P=0.000)。

2.3ZNF772基因启动子区DNA甲基化与胰腺癌病理特征的关系：在胰腺癌组中，不同临床分期、组织学分化、淋巴结转移、远处转移患者的ZNF772基因启动子区DNA甲基化率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 ZNF772基因启动子区DNA甲基化与胰腺癌病理特征的关系[n(%)，n=118]

2.4多因素分析：在胰腺癌组中，Logistic回归显示临床分期、组织学分化、淋巴结转移、远处转移都为影响ZNF772基因启动子区DNA甲基化的重要因素(P<0.05)。见表3。

表3 影响胰腺癌ZNF772基因启动子区DNA甲基化的多因素分析

3 讨论

胰腺癌是临床上较常见的恶性肿瘤之一，该病恶性程度较高，淋巴、肝脏转移率也相对较高，很多患者在就诊时失去了手术指征，且放疗和化疗不够敏感，这也使得预后一直较差，为此积极探索胰腺癌的发病机制具有重要价值[9]。胰腺癌致病相关因素有环境、遗传等[10]。表观遗传学是指DNA序列无变化，而是相关化学修饰来改变基因的功能，如小RNA调控、DNA甲基化、染色体组蛋白修饰等。特别是DNA的异常甲基化可使抑癌基因启动子区CpG岛出现异常甲基化，导致抑癌基因失活；也可激活癌基因，促进肿瘤增殖与转移[11]。ZNF蛋白家族数量庞大，与多种人类肿瘤相关，已发现ZNF亚型的异常表达与胰腺癌的发生发展相关[12]。从机制上分析，CpG岛主要位于ZNF772基因的启动子区域，DNA的甲基化通常发生于CpG岛上，主要为在胞嘧啶的第五位碳原子上加上一个甲基化基因，从而变成5-甲基胞嘧啶[13]。ZNF772基因能够抑制恶性肿瘤细胞的侵袭、转移，抑制癌血管生成，但是DNA甲基化可导致ZNF772基因表达水平降低，从而诱发恶性肿瘤的形成[14-15]。肿瘤侵袭与转移是导致恶性肿瘤患者预后死亡的重要原因，其也是一种遗传学与表观遗传学过程。而DNA甲基化可使恶性肿瘤患者的表观遗传学模式被破坏，导致抑癌基因表达受到抑制[16-17]。而经去DNA甲基化治疗，可达到抑制肿瘤发生的目的[18-19]。本研究显示在胰腺癌组中，不同临床分期、组织学分化、淋巴结转移、远处转移患者的ZNF772基因启动子区DNA甲基化率比较差异有统计学意义；Logistic回归显示临床分期、组织学分化、淋巴结转移、远处转移都为影响ZNF772基因启动子区DNA甲基化的重要因素。当前也有研究表明，相对于健康正常人，80%以上的胰腺癌患者存在关键性肿瘤抑制基因的甲基化，并且DNA甲基化发生在遗传学改变之前，为此早期检测到抑癌基因启动子区域甲基化状态有利于预测患者的病情与预后状况[20-22]。不过本研究也存在一定的不足，调查的病例数量比较少，没有纳入正常对照组，将在后续研究中进行探讨。总之，胰腺癌患者多伴随有ZNF772基因启动子区DNA甲基化，从而导致ZNF772基因表达水平下降，ZNF772基因启动子区DNA甲基化可能作为一种监测胰腺癌病情的重要指标。