Notch信号通路中Notch2在胰腺癌中表达及临床意义

李东伟，依马木买买提江·阿布拉，李海军，周婧博，张 波

(1.深圳市罗湖医院集团罗湖区人民医院普外科，广东 深圳 518000；2.新疆医科大学附属肿瘤医院肝胆胰外科，新疆 乌鲁木齐 830006)

胰腺癌的发病率在全球范围呈逐年上升趋势[1]，但早期诊断困难，确诊时往往已到中晚期，手术切除术率很低，放化疗后仍容易复发和转移[2]。而随着医疗技术的发展，国内外学者研究发现，Notch信号通路在胰腺癌的发生、发展中起着重要的作用[3]。Mazur等[4]发现，选择性阻断Notch2而非Notch1可以使胰腺癌演变进程停止，延长生存期。因此，本研究从转录、翻译两个水平检测Notch2的表达情况及其与胰腺癌患者临床病理特征的关系，以期探索胰腺癌发生发展新的分子机制。

1 资料与方法

1.1一般资料：收集新疆医科大学附属肿瘤医院2015年2月～2017年2月胰十二指肠手术标本48例，术后经病理确诊全部为胰腺导管腺癌患者，手术后即刻切取胰腺癌组织和配对的癌旁组织(距癌3 cm组织)，置液氮贮存。48例患者术前均未经放化疗，33～80岁，平均58.3岁，其中男28例，女20例。病理检查：其中中高分化癌21例，低分化癌27例；肿瘤直径≤2 cm 23例，>2 cm 25例；胰腺癌分期(AJCC，第8版)标准进行分期，Ⅰ期和Ⅱ期20例，Ⅲ期和Ⅳ期28例；浸润深度T1～T2期22例，T3～T4期26例；有淋巴结转移18例，无淋巴结转移30例；CA19-9>34 U/ml 25例,CA19-9≤34 U/ml23例。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.2方法

1.2.1采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Sufu表达：按30 mg新鲜胰腺组织加入1 ml的Trizol试剂提取组织总RNA，然后用紫外分光光度计检测总RNA样品的纯度和浓度，按照两步法RT-PCR试剂盒说明书将1 μg总RNA反转录成cDNA后进行PCR反应。Notch2引物：上游5′-CAACCCCAGATAGGAAGCAG-3′，下游5′-GAGCCTTTTCCCCATATTCC-3′，扩增片段102 bp；β-actin引物，上游5′-GGGACCTGACTGACTACCTC-3′,下游5′-CGTCATAC TCCTGCTTGCTG-3′，扩增片段543 bp。引物均由上海生工生物工程公司合成。PCR反应条件：94℃预变性2 min，接着94℃变性30 s、退火30 s，然后72℃延伸30s，30个循环，最后72℃终延伸2 min。退火温度分别为57℃、56℃。所得PCR终产物10 μl用2%琼脂糖凝胶电泳，BIO-RAD Gel Doc XR凝胶成像系统进行灰度扫描，后用Image Lab 4.0软件分析结果。测定目的基因Notch2扩增条带与内参基因β-actin扩增条带的光密度比值，以此作为Notch2基因mRNA的相对表达量。

1.2.2采用Western印迹检测Notch2蛋白表达：新鲜胰腺组织加入蛋白质裂解液后冰上研磨提取组织总蛋白，所用一抗、二抗均购自Santa Cruz公司。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，取50 μg蛋白样品，用100 V恒压SDS-PAGE分离，电转移到PVDF膜上，用封闭液室温下封闭PVDF膜1 h，分别加入Notch2兔抗人抗体(1∶300)、β-actin兔抗人抗体(1∶1 000)，4℃孵育过夜，用1×TBST漂洗，分别于相应的二抗孵育30 min后洗膜。加入ECL化学发光试剂，用Bio-Rad Chemi DOC MP全能型成像系统拍照，并用Image Lab 4.0软件分析。测定目的基因Notch2蛋白条带与内参基因β-actin蛋白条带的光密度比值，以此作为Notch2基因蛋白的相对表达量。

1.3统计学方法：应用SPSS22.0统计软件进行t检验。

2 结果

2.1RT-PCR检测结果：胰腺癌组织中Notch2 mRNA的相对表达量为0.713±0.032，胰腺癌旁组织中Notch2 mRNA的相对表达量为0.312±0.026，胰腺癌组织中Notch2 mRNA的表达量是胰腺癌旁组织的(2.285±0.294)倍，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、表1。

注：1,2,3为胰腺癌组织;4,5,6为胰腺癌旁组织

2.2Western印迹检测结果：胰腺癌组织中Notch2蛋白的相对表达量为0.621±0.047，胰腺癌旁组织中Notch2蛋白的相对表达量为0.297±0.052，胰腺癌组织中Notch2蛋白的表达量是胰腺癌旁组织的(2.091±0.169)倍，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、表1。

表1 Notch2 mRNA和蛋白在胰腺癌组织和癌旁组织平均表达水平差异

注：1,2为胰腺癌组织;3,4为胰腺癌旁组织

2.3胰腺癌组织中Notch2 mRNA的表达与临床病理特征的关系：低分化胰腺癌Notch2 mRNA平均表达水平(0.853±0.061)高于中高分化胰腺癌(0.578±0.029)，Notch2 mRNA在Ⅲ期、Ⅳ期胰腺癌组平均表达水平(0.876±0.043)高于Ⅰ期、Ⅱ期胰腺癌组(0.532±0.037)，差异均有统计学意义(P<0.05)。Notch2 mRNA表达水平与胰腺癌的分化程度和TNM分期明显相关(P<0.05)，与患者年龄、性别、肿瘤直径、浸润深度、淋巴结转移和CA19-9无明显相关。见表2。

2.4胰腺癌组织中Notch2蛋白的表达与临床病理特征的关系：低分化胰腺癌Notch2 蛋白平均表达水平(0.738±0.038)高于中高分化胰腺癌(0.509±0.052)，Notch2 蛋白在Ⅲ期、Ⅳ期胰腺癌组平均表达水平(0.783±0.054)高于Ⅰ期、Ⅱ期胰腺癌组(0.413±0.035)，差异均有统计学意义(P<0.05)。Notch2 蛋白表达水平与胰腺癌的分化程度和TNM分期明显相关(P<0.05)，与患者年龄、性别、肿瘤直径、浸润深度、淋巴结转移和CA19-9无明显相关(P>0.05)。见表2。

表2 胰腺癌组织 Notch2 mRNA和蛋白的表达与临床病理特征的关系

3 讨论

Notch信号通路普遍存在于各种生命体中，不仅决定细胞命运、胚胎、个体发育及成体微环境稳定，而且参与了多种肿瘤的发生发展[5]，近年来研究发现Notch信号通路与胰腺癌的发生发展密切相关[3,6]。在胰腺发育过程中有四种Notch基因表达，其中Notch2在胰芽分支和导管发生时，局限表达于胰腺胚胎导管细胞，所以推测Notch2是胰腺干细胞的标志物之一[7-8]。Mazur等[4]研究Kras小鼠发现，在胰腺上皮内瘤变(PanINs)进展过程中，Notch1在胰腺腺泡细胞呈高表达，Notch2在胰腺导管细胞呈高表达，进一步采用γ-分泌酶抑制剂阻断Notch信号通路发现PanINs进展延缓，提示Notch信号通路在调控PanINs进展中起关键作用。

本研究RT-PCR和Western印迹检测结果均显示：胰腺癌组织中Notch2 mRNA和蛋白表达均高于癌旁组织。胰腺癌组织中Notch2 mRNA和蛋白表达与胰腺癌的分化程度和TNM分期明显相关，与患者年龄、性别、肿瘤直径、浸润深度、淋巴结转移和CA19-9无明显相关。

综上所述，Notch信号通路中Notch2基因在胰腺癌组织中高表达，且该基因表达量与胰腺癌的分化程度和TNM分期有关，表明Notch信号通路参与了胰腺癌的发生发展。进一步研究Notch2在胰腺癌中如何表达调控，将有助于阐明胰腺癌发生发展的分子机制。