半枝莲新克罗烷型二萜对人OCI-LY1淋巴瘤细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

刘谦，陈敏，徐芳华，喻友爱，刘勇

（1.江西省人民医院南昌医学院第一附属医院病理科，南昌 330006；2.南方医科大学附属萍乡医院病理科，萍乡 337055）

半枝莲又名韩信草，马唇形科黄芩属多年生草本植物，广泛分布于我国南方湿地，功效为清热解毒、化瘀利尿，主治疔疮肿毒、咽喉肿痛等[1]。据《中华肿瘤治疗大成》载，半枝莲作为抗肿瘤药物，主治原发性肝癌、胃癌等消化道肿瘤、肺癌及子宫颈癌等[2]。同时，有部分研究将半枝莲联合化疗用于弥漫性大B细胞淋巴瘤的治疗[3]。现代研究表明，半枝莲的有效成分中，黄酮、多糖、二萜等具有良好的抗肿瘤活性[4]。近年来在半枝莲二萜类化合物中，发现部分新克罗烷型二萜具有显著抗肿瘤活性[5-6]。本研究利用弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞株OCI-LY1作为研究对象，探讨半枝莲新型克罗烷二萜J（SJ）对其增殖、凋亡及细胞周期的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人弥漫性大B细胞淋巴瘤OCI-LY1细胞株（上海通派生物科技有限公司），半枝莲二萜J（江西省人民医院药剂科），CCK-8（日本同仁化学，CK04），胎牛血清（Ausbian，VS500T），DMEM（Corning，10-013-CVR），凋 亡 试 剂 盒 （eBioscience，88-8007），PI（Sigma，P4170），RNase A（Fermentas，EN0531），BCR试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，P0010S），cyclin D3（CST公司，1∶500稀释）。

1.2 仪器 细胞计数仪（Nexcelom Cellometer，Auto 1000），酶标仪（Tecan infinite，M2009PR），流式细胞仪（BD，C6 PLUS），荧光显微镜（OLYMPUS，IX71），SDS-PAGE蛋白电泳仪（上海天能，VE-180），蛋白转膜仪（上海天能，VE-186）。

1.3 细胞培养及药物配制 人弥漫性大B细胞淋巴瘤OCI-LY1细胞培养于10%胎牛血清FBS，于37℃、5% CO2培养箱中培养，2~3天传代。半枝莲二萜J用DMSO配制成1 mg/mL，4℃储存备用。

1.4 CCK-8实验 将OCI-LY1细胞悬液以每孔2×103个细胞、每孔100 μL接种于96孔板，待细胞沉淀后，用不同质量浓度的半枝莲二萜J（10、15、20、30、40、60、80、100 μg/mL）处理细胞，同时，设置DMSO作为对照组，作用24、48、72小时；每孔加入10 μL CCK-8，培养2小时后，酶标仪450 nm处测定各孔吸收光度值（A），计算各组细胞活性（%）=实验组A/正常对照组A×100%。

1.5 流式细胞仪检测OCI-LY1细胞凋亡率 将OCI-LY1细胞悬液以每孔2×105个细胞、每孔2 mL接种于6孔板，待细胞沉淀后，用不同质量浓度的半枝莲二萜J（0、20、40、60 μg/mL）处理细胞，培养24小时；收集细胞，用Binding buffer洗涤细胞后，加入4 μL PI染色，重悬细胞，再加入10 μL Annexin V-APC染色，避光15分钟后，用流式细胞仪检测各组细胞凋亡。

1.6 PI-FACS细胞周期检测 将OCI-LY1细胞悬液培养于6 cm dish中，用不同质量浓度半枝莲二萜J（0、20、40、60 μg/mL）处理细胞，培养24小时；收集细胞离心后，经4℃D-Hanks洗涤、75%乙醇固定处理后，按PI∶RNase∶D-Hanks=25∶10∶1000配比进行细胞染色，用流式细胞仪检测并分析数据。

1.7 Western blotting法检测cyclin D3蛋白的表达用不同质量浓度半枝莲二萜J（0、20、40、60 μg/mL）处理细胞，培养24小时后收集OCI-LY1细胞，PBS洗涤两次，加入RIPA裂解液，冰上裂解10分钟，转移至EP管中，超声破碎细胞（40 w，每次1秒，间隔2秒，共20次）。4℃、12000 g，离心15分钟，测定蛋白浓度。每条泳道加蛋白50 μg，进行SDS-PAGE，并转移至PVDF膜上。用含5%脱脂牛奶的TBST溶液室温封闭PVDF膜1小时，与一抗cyclin D3室温孵育2小时，并用TBST洗膜4次，每次8分钟；再与二抗室温孵育1.5小时，并用TBST洗膜。将PVDF膜置于暗盒，胶片曝光，冲洗胶片，并检测蛋白表达情况。

1.8 统计学处理方法 采用IBM SPSS 23.0软件进行数据分析，以（±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 半枝莲二萜J对OCI-LY1细胞增殖的影响半枝莲二萜J可以明显抑制OCI-LY1细胞增殖，并呈时间和剂量依赖性（图1），不同质量浓度半枝莲二萜J作用下，细胞增殖抑制率均高于DMSO对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 半枝莲二萜J对OCI-LY1细胞增殖的影响

2.2 半枝莲二萜J对OCI-LY1细胞凋亡的影响比较不同质量浓度半枝莲二萜J对OCI-LY1细胞凋亡的影响后发现，加入20 μg/mL半枝莲二萜J处理组和不加药组坏死细胞之间没有出现差异（P＞0.05），但早期凋亡和晚期凋亡率之间的差异有统计学意义（P＜0.05）；加入40 μg/mL和60 μg/mL半枝莲二萜J处理后的细胞坏死率、早期和晚期凋亡率与不加药组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1，图2。

图2 半枝莲二萜J对OCI-LY1细胞凋亡的影响

表1 半枝莲二萜J对OCI-LY1细胞凋亡的影响（±s，n=3）

表1 半枝莲二萜J对OCI-LY1细胞凋亡的影响（±s，n=3）

浓度（μg/mL）早期凋亡率（%）晚期凋亡率（%）坏死率（%）存活率（%）0 20 40 60 1.90±0.26 3.83±0.25 4.50±0.26 7.03±0.42 1.60±0.17 2.80±0.26 10.77±0.31 28.40±0.79 0.77±0.15 0.77±0.25 3.83±0.75 5.93±0.85 95.70±0.36 92.57±0.42 80.97±0.32 58.63±0.21

2.3 半枝莲二萜J对OCI-LY1细胞周期的影响作用24 h后，比较不同质量浓度半枝莲二萜J对OCI-LY1细胞周期的影响后发现，与不加药组相比，加40 μg/mL和60 μg/mL半枝莲二萜J处理后处于各个周期的细胞总数之间均存在统计学差异（P＜0.05）；在加入20 μg/mL半枝莲二萜J中，只有处于S期的细胞总数与之相比差异无统计学意义（P＞0.05），处于G0/G1期和G2/M期的细胞总数之间差异有统计学意义（P＜0.05），见表2，图3。

图3 半枝莲二萜J对OCI-LY1细胞周期的影响

表2 半枝莲二萜J对OCI-LY1细胞周期的影响（±s，n=3）

表2 半枝莲二萜J对OCI-LY1细胞周期的影响（±s，n=3）

质量浓度（μg/mL）0 20 40 60细胞周期分布（%）G0/G1 S G2/M 51.09±0.72 54.44±0.79 73.48±0.87 66.21±0.56 34.61±0.63 33.95±0.49 17.96±1.02 26.54±0.57 14.30±0.24 11.61±0.37 8.56±0.35 7.24±0.44

2.4 半枝莲二萜J对OCI-LY1细胞cyclin D3蛋白表达的影响 用不同质量浓度（0、20、40、60 μg/mL）半枝莲二萜J处理OCI-LY1细胞后，在31kDa处检测到目标条带，其cyclin D3蛋白表达均明显减弱，并呈剂量依赖性，见图4。

图4 半枝莲二萜J对OCI-LY1细胞cyclin D3蛋白表达的影响：半枝莲二萜J（μg/mL）

3 讨论

半枝莲为唇形科黄芩属植物Scutellaria barbata D.Don的干燥全草，始载于《药镜拾遗赋》。其性辛、苦、寒，具有清热解毒、消肿止痛等功效[7]。在中医治疗中，常用其单方或复方治疗各种肿瘤[8]。半枝莲的药理研究证实，其提取物在体外和体内是肝癌的有效抑制剂[9]。从半枝莲中分离得到的叶绿素a的衍生物，可以通过抑制P-糖蛋白的表达，并诱导HepG2的细胞周期阻滞来降低耐药性[10]。本实验结果表明，半枝莲二萜J能够抑制OCI-LY1细胞增殖，且具有时间和剂量依赖性，并使cyclin D3表达降低，呈剂量依赖性。

流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示，半枝莲二萜J以剂量依赖性方式诱导OCI-LY1细胞凋亡，随剂量的递增，其早期凋亡率和晚期凋亡率均增大。但在20 μg/mL半枝莲二萜J处理组和不加药组凋亡细胞之间没有出现差异，而加入40 μg/mL和60 μg/mL半枝莲二萜J处理后的细胞凋亡率与不加药组之间均出现统计学差异，推测可能是随着剂量的增加，细胞凋亡越来越明显，进一步支持了其对细胞凋亡的影响。

本研究在细胞周期方面的结果显示，半枝莲二萜J主要使细胞阻滞于G0/G1期，随剂量浓度的增大，处于G0/G1期的细胞逐渐增多，在质量浓度40 μg/mL时达到峰值。同时，随半枝莲二萜J质量浓度的增大，处于S期的细胞也逐渐减少，在质量浓度40 μg/mL时达到峰值。但在S期中，20 μg/mL半枝莲二萜J处理组相比不加药组之间的差异并没有统计学意义，推测可能由于药物质量浓度小导致差异不明显。另外，G2/M期细胞也以剂量依赖的方式逐渐减少，说明半枝莲二萜J对OCILY1细胞周期的阻滞作用。

由于细胞周期蛋白在细胞周期调控中的重要作用，细胞周期依赖性蛋白激酶（Cyclin Dependent Kinases,CDKs）和周期蛋白被广泛研究[11]。D型细胞周期蛋白（cyclin D）作为有丝分裂传感器，直接将生长因子信号与G1期进展联系起来。同时，cyclin D的降解与大量人类肿瘤相关[12]。cyclin D包括3个亚型：cyclin D1、cyclin D2和cyclin D3，能促进细胞增殖，同时加快细胞周期进程。cyclin D3是G1期CDK4/CDK6的调节亚基，同时作为CDK11P58的伙伴，参与G2/M期的调节[13]。最近有研究证实，cyclin D3与CDK1、CDK2和CDK14之间也有一定相关性[14]。在淋巴造血系统的研究中，cyclin D3被认为是与中国非霍奇金淋巴瘤发病关系最密切的D类细胞周期蛋白，其表达水平与恶性程度呈明显正相关[15]。本研究采用Western blotting法检测不同质量浓度半枝莲二萜J作用OCI-LY1细胞，cyclin D3在蛋白水平的表达变化后发现，半枝莲二萜J以剂量依赖方式使OCI-LY1细胞cyclin D3蛋白表达降低，推测cyclin D3的表达下调可能与弥漫性大B细胞淋巴瘤的发生、发展有关。

弥漫性大B细胞淋巴瘤作为我国最常见的淋巴造血系统肿瘤，治疗方法多以化疗为主[16-17]，但对于部分复发难治的患者，疗效仍不能让人满意。本研究以弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞株OCI-LY1细胞为研究对象，发现半枝莲二萜J可以通过下调cyclin D3的表达从而阻滞肿瘤细胞周期进展并诱导细胞凋亡，随着研究的逐渐深入，有望为弥漫性大B细胞淋巴瘤的治疗带来新的可能。