杜仲中超氧化物歧化酶1抑制成分的虚拟筛选及分子动力学研究

赵泽丰，亢恺雯，年 梦，王 强，乔海法*，钱明成

1.陕西省针药结合重点实验室，咸阳 712046；2.陕西中医药大学针灸推拿学院，咸阳 712046；3.陕西中医药大学第二临床医学院，咸阳 712046；4.常州大学制药与生命科学学院，常州 213164

肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一种致命的神经退行性疾病，其发病会导致神经元死亡，进而使得肌肉萎缩[1]。ALS的常见发病原因之一是超氧化物歧化酶-1(superoxide dismutase 1，SOD1)基因的突变，导致SOD1的错误折叠和聚集。错误折叠的SOD1与金属辅因子结合的能力降低，形成一个功能同源二聚体或激活它的铜伴侣，从而使得患者抗氧化能力减弱而聚集大量活性氧从而造成对神经元的氧化损伤[2]。有研究表明，包括依布硒啉等的活性化合物能够通过与SOD1结合而稳定SOD1的突变体进而起到潜在的抗ALS的作用[3]，通过对活性化合物药效团及其与SOD1相互作用位点的研究从而对抗ALS化合物进行虚拟筛选有一定的可行性。中医认为，ALS根据其临床表现可归于“痿证”论治，其病机主要包括肝肾亏虚与髓枯筋痿等，针对这一主证，杜仲作为具有补益脾肾及强筋骨功效的药味在治疗ALS的方剂中被广泛使用。明代龚廷贤用包含杜仲的方剂起痿丹治疗肾气虚腰膝酸痛，行步无力，谢正文的健歩虎潜丸及马佩涑的类补阳还五汤均用到杜仲，以杜仲为代表的补虚药历代治疗痿证的使用频率居于高位[4]。2015年版《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)收载杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的干燥树皮为正品，现代药理研究表明，杜仲具有降血压、降血脂、保肝及保护神经等多种生物活性[5]。

本文运用虚拟筛选的手段，基于药效团分子对接及分子动力学模拟手段，预测杜仲中具有潜在SOD1抑制作用的成分及其与该靶标的结合模式，为进一步开展针对该药的实验研究及临床应用提供理论依据。

1 方法

1.1 杜仲化学成分收集

通过对在线数据库及文献的检索，对杜仲中的化学成分进行收集。检索的在线数据库主要包括：TCMID数据库(http://www.megabionet.org/tcmid/)[6]以及PubChem数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。收集的化合物信息主要包括化合物的结构名称及CAS编号，在MM2力场下对所有小分子的3D结构进行能量最小化，建立包含杜仲中所含成分3D结构的化合物库。

1.2 药效团的构建

参照刘广欣等[7]构建药效团的方法，本研究使用Discovery Studio软件中的Common Feature Pharmacophore Generation 模块来构建基于小分子配体的HipHop药效团模型。从文献报道中选取与成药依布硒啉相近的6个具有SOD1抑制活性的小分子化合物作为训练集[2-3,8-10]。见图1。基于训练集中小分子的共同特征结构比对、叠合、自动生成药效团模型。采用Discovery Studio中的Ligand Profiler模块，对生成的10个药效团进行评价，选取训练集中的化合物以及ZINC数据库中经FDA批准的未见SOD1活性报道的500个非活性化合物作为测试集，对生成的药效团进行评估，要求最终所选取的药效团在评分值尽可能高的情况下具有与活性化合物匹配度较高而与非活性化合物匹配度较低的特性。

图1 训练集化合物的结构

1.3 分子模拟对接研究

采用Discovery Studio中的Flexible Docking模块，对经优选药效团匹配得到的化合物进行分子模拟对接研究。在PDB(http://www.rcsb.org)数据库中，选取RAMU MANJULA等[9]解析的SOD1与活性配体Lig9的复合物蛋白结构(PDB ID：6A9O)作为靶点进行后续研究。随后将复合物中的小分子配体抽离，删去水分子，添加极性氢并修复不完整残基后结合原配体在6A9O中的作用位点生成半径为10 Å的结合口袋。将经药效团筛选得到的杜仲成分库中的化合物对接到设定的活性口袋中，结合原配体的作用情况，将受体中的Active Site AD4区域，即F链上的残基LYS 30、TRP 32、SER 98、ILE 99、GLU 100及I链上的GLY 33与ASP 96定义为构象可旋转的柔性残基进行柔性对接，以CDOCKER interaction energy作为指标初步评价小分子配体与受体的结合情况，并结合氢键及非键相互作用分析对接结果的合理性。

本研究还采用Autodock Vina的柔性对接模块辅助验证对接结果，将处理好的SOD1蛋白以原配体为中心(x=22.543 588,y=223.175 774,z=51.239 740)生成大小为20 Å×20 Å×20 Å的Grid盒子，定义柔性残基后进行对接，以Binding Affinity为评价指标评估小分子配体与受体的结合情况，并与Discovery Studio得到的结果进行比对。

1.4 分子动力学模拟

参照文献报道的方法[11]，分子动力学模拟的操作采用Linux系统GROMACS软件，在32核心CPU，GTX-1660 GPU加速的服务器上进行运算。采用等温等压(NPT)系统以及周期性边界条件进行。将靶点蛋白SOD1、对接评分最高的配体vladinol D(100)及hedyotol C(102)、水及抗衡离子均赋予AMBER力场。采用静电吸引Particle-Mesh Ewald(PME)算法，截断距离为1.4 nm，在此体系内对蛋白配体复合物进行50 ns的分子动力学模拟。

2 结果与讨论

2.1 杜仲化合物库的构建

通过对文献的收集与整理，共得到杜仲中的成分118种，见表1，其中包含以儿茶酸(2)及咖啡酸(8)为代表的酚类成分28种(1～28)；以杜仲醇(29)及杜仲苷Ⅰ(32)为代表的杜仲中的特征性成分环烯醚萜苷类27种(29～55)；以山柰酚及槲皮素为代表的黄酮类成分23种(56～78)；以《中国药典》中规定的杜仲内标物松脂醇二葡萄糖苷(87)为代表的木脂素类成分27种(79～103)；以白桦脂酸(110)为代表的萜类成分8种(104～111)及其他化合物8种(112～118)。

表1 杜仲成分库中收录的化合物信息

表1(续) 杜仲成分库中收录的化合物信息

2.2 药效团的构建与评价

用HipHop方法共产生了10个药效团模型，其结果参数见表2。评分值参考了训练集分子与药效团模型的匹配度，可以看出生成的10个药效团评分都超过了50分，表明测试集所选的分子共同特征较为明显。药效团热图见图2。图2中暖色调表示药效团对配体响应度较高，而冷色调则表示对配体的响应度较低。由表2和图2可知，由2个氢键配体、1个疏水中心及1个芳环中心构成的四点药效团02对于测试集中活性化合物的响应度较高，而对于非活性化合物的响应值较低，符合本研究对于药效团的要求，故选择药效团02作为对象进行后续研究。

表2 10个基于分子共同特征的药效团的结果参数

图2 10个生成的药效团对测试集分子的验证热图

2.3 优选药效团对杜仲中抗ALS活性成分的虚拟筛选

将优选药效团02与杜仲成分库匹配后，在FAST模式的构象约束条件下，可以匹配到41种成分，将其按照匹配度(Fit value)由高到低排列，选取匹配度最高，即最符合SOD1抑制剂结构特征的6种小分子进行进一步研究(Fit value>3.4)。初步筛选出的具有潜在研究价值的化合物包括vladinol D(100)、hedyotol C(102)、(+)-pinoresinol(松脂醇，82)、threo-guaiacylglycerol-β-coniferyl aldehyde ether(95)、(-)-olivil(橄榄树脂素，96)和lariciresinol(落叶松脂醇，98)。其对于药效团的Fit value分别从3.63依次降低至3.41。见图3。可以看出经药效团筛选到的潜在SOD1抑制剂的骨架类型均为木脂素类，其中化合物(+)-pinoresinol为双环氧木酯素类化合物；threo-guaiacylglycerol-β-coniferyl aldehyde ether属于新木脂素类化合物；(-)-olivil，lariciresinol及vladinol D均属于单环氧型木脂素类化合物；而hedyotol C及hedyotol D属于倍半木脂素类化合物。表明相较于酚类、环烯醚萜苷类、黄酮类及皂苷类化合物，杜仲中的木脂素化合物可能具有更强的潜在SOD1抑制活性从而起到抗ALS作用。从药效团的匹配结果可以看出木脂素一侧结构单元中的苯环能够满足药效团中芳香中心的要求，而其侧链上的甲氧基等结构能够提供一定的疏水性，与芳环的距离能满足药效团中芳环中心到疏水中心的距离要求，其中的氧原子也能够较好地满足氢键受体的要求，能与SOD1结合口袋中的残基产生潜在的相互作用。

图3 最优药效团02与6种匹配到的杜仲中潜在活性化合物结合模式图

2.4 分子模拟对接结果

在药效团筛选得到潜在活性化合物后，采用分子模拟对接技术对筛选得到的化合物与ALS潜在靶点SOD1的相互作用进行评估，结果见图4。由图4可见，筛选得到的化合物均与靶点蛋白产生了较好的相互作用。筛选化合物与6A9O关键残基的相互作用见表3。综上，分子模拟对接得出的结果与药效团匹配数值相近，6种小分子配体与靶点的结合评分均高于40，表明两者具有较高的结合能。而化合物作用的关键残基也与原配体相近，由PDB数据库中的数据可知，原配体与6A9O作用口袋结构中的关键残基为F链上的SER 98、LYS 30、TRP 32以及Ⅰ链上的GLY 33等，而杜仲中的6种化合物也不同程度地与上述残基发生了相互作用。

图4 杜仲中6种潜在活性化合物与SOD1靶点的分子对接相互作用模式图

从对接的结果可知，由于木脂素类结构含有多个富电子的氧原子，易与SOD1靶点残基中的供电子基团形成氢键，其中关键残基SER 98与化合物100及82产生了潜在的相互作用，而根据其他药物蛋白共晶结果，此残基为抗癌药物5-氟尿嘧啶核苷(5?偉cfuorouridine，5-FU)与SOD1的作用位点之一[25]，同样也是本研究所采用的原配体与SOD1的作用位点；此外关键残基LYS 30同样为5-氟尿嘧啶核苷的作用位点，该位点还是中药活性成分槲皮素及黄岑素与SOD1的关键作用位点，通过突变体验证及动力学模拟发现，这2种黄酮可以通过与该位点产生相互作用降低原纤维的聚集，从而起到抗ALS作用[26]，该位点与除96外的其余5种化合物均产生了潜在的相互作用；与化合物96作用的关键残基LYS 3及与化合物100作用的残基TRP 32也被证明在SOD1中起着重要作用，通过高通量虚拟筛选方法从包含30 000个化合物的库中得到的活性先导物通过下拉实验被证明，能够通过与上述2种残基发生相互作用，从而在体外影响SOD1突变体与微管蛋白的蛋白-蛋白相互作用，从而发挥抗ALS活性[27]，值得一提的是，该研究提出TRP 32中色氨酸与芳香性化合物的π-π电子-电子堆积对于SOD1突变体与微管蛋白的作用有着重要影响，而本研究筛选到的杜仲中的单体化合物102与100也与该残基存在π-π堆积作用，为这2种化合物的潜在抗ALS活性提供了证据；多种关键残基的潜在相互作用证明木脂素类结构作为抗SOD1活性化合物的骨架是合理的。

在杜仲活性化合物中，氢键往往在木脂素骨架苯环4位上羟基(100、102、82、95、96)及2个芳环之间的呋喃环(82、96、98)上产生，可见上述位置的取代基对于化合物的活性存在重要的影响。6种化合物的得分由高到低的次序为：100>102>96>95>82>98，总体与药效团匹配顺序相符，部分化合物对接结果与药效团匹配度略有差异，而Autodock Vina给出的结果的趋势与Discovery Studio大致相近，得分由高到低的次序为：100>102>95>82>98>96，总体而言，该类化合物与靶标具有较好的潜在结合效果。以评分高低表示活性强弱，大致可以得出初步的构效关系：①木脂素芳环上多甲氧基取代有利于其与SOD1的潜在相互作用；②呋喃或双呋喃环的存在对于其与SOD1的潜在相互作用有着重要作用。而在实际的活性测定过程中，目前尚无筛选得到的6种活性化合物针对ALS或SOD1靶点的报道。针对6种匹配到的潜在活性化合物，更加系统且具有重复性的实验有待进一步进行。

目前关于木脂素类化合物的SOD1抑制作用尚不明确，有研究表明，木脂素类化合物具有潜在的抗神经退行性病变的作用[28]，可为本研究的结果提供参考，CLAUDIO GIULIANO等[29]从挪威云杉Piceaabies中分离得到木脂素7-hydroxymatairesinol在帕金森模型大鼠中能够抑制多巴胺能纹状体的末端变性从而起到抗帕金森病的作用。自五味子中分离得到的木脂素类化合物能够有效地抑制β淀粉样蛋白的聚集，通过增强超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，降低乳酸脱氢酶、丙二醛和活性氧的水平，减弱Aβ1-42诱导的神经元损伤从而具有抗阿尔茨海默病的潜在活性[30]。此外，自细辛根中分离得到的木脂素类化合物芝麻素被证实具有抗6-羟基多巴胺诱导的神经毒性的显著作用[31]，进一步的机制研究表明，该单体具有调节胞外信号、调节激酶1/2的瞬时磷酸化以及抑制p38促分裂原活化蛋白和c-Jun持续磷酸化的作用。

表3 杜仲中6种潜在活性化合物与SOD1靶点的分子对接评价

2.5 分子动力学模拟结果

将化合物100、102的对接结构作为初始构象，分别进行了50 ns的分子动力学模拟，并绘制均方根偏差(root mean square deviation，RMSD)变化及均方根波动(root mean square fluctuation，RMSF)。其中RMSD是用于评价分子动力学模拟过程中当前构型与初始构型变化大小的数值，是用来评价体系是否达到平衡的标准，波动越小表示配体与蛋白结合得越紧密。见图5。由图5可知，化合物100及102与SOD1的复合物体系均在约30 ns后趋于平衡，曲线保持在3 Å范围内合理波动，通过曲线对比可以发现相较于化合物102，化合物100与SOD1的结合更为稳定，这与分子模拟对接的结果一致。由RMSF曲线可见，出现较大范围波动的区域主要为蛋白链上无规则卷曲的loop区，例如GLY 138-SER 142，其稳定性由于自身结构所致波动较大。2条曲线对比，化合物100的总体波动较小，且在结合位点周围的蛋白较总体稳定，初步印证了我们关于分子模拟对接结果的判断及化合物102与SOD1的作用强于化合物100，其具有作为先导化合物进一步开发为抗ALS临床候选的可能性。

图5 化合物100(粉线)及102(蓝线)与SOD1分子动力学模拟RMSD(A)及RMSF曲线(B)

3 结论

药效团、分子模拟对接及分子动力学模拟是药物设计学中发现活性物质最为重要的几种手段，将其应用于中药药效物质研究中，能够降低研究成本，提高研究效率。本研究通过调研文献，建立了杜仲中所含成分的化合物库，基于已报道的具有SOD1抑制活性的化合物构建了HipHop药效团模型，并对药效团匹配到的杜仲中的化学成分进行了与SOD1靶点的分子模拟对接，最终发现了6种具有潜在SOD1抑制活性的化合物，通过分子动力学模拟对打分位于前2位的化合物进行了研究，发现配体-受体复合物的稳定性与分子模拟对接结果基本一致。本研究通过提取其类似物的化学特征建立了药效团并筛选出具有新颖母核的木脂素类化合物作为潜在的SOD1抑制剂，为新型抗ALS药物的研发奠定了理论基础。包含药效团与分子对接技术在内的虚拟筛选手段被广泛用于活性先导物的发现中，采用这些手段对包含中药在内的复杂成分库进行前期筛选，相较于高通量筛选等手段能够有效降低实验成本并更高效地发现候选化合物[32-33]，为进一步的基于药理或药动学的结构优化提供理论依据。杜仲为陕西省道地药材之一，从杜仲中发现对ALS等难治性疾病有治疗活性的单体对杜仲资源的开发、利用与进一步产业化有着重要的意义。随着技术手段的进步，相信越来越多的依托于中药的更为安全有效的健康产品会被用于ALS等疑难杂症的治疗。本研究也具有一定局限性，筛选的化合物并未考虑其含量及制备的难度，且目前ALS验证模型主要以SOD1表达缺陷的转基因动物模型为主，验证具有一定难度，具体的药效学及药动学特征仍亟待观察。