基于SNAP-tag-EGFR细胞膜色谱的北豆根中潜在抗肿瘤活性组分筛选及验证

付 佳，贾倩倩，韩省力，贺浪冲*

1.西安交通大学药学院，西安 710061；2.西安医学院基础与转化医学研究所，西安 710021

中药用于人类疾病的预防和治疗已有数千年的历史，其具有多组分、化学成分复杂的特点，其有效成分是中药药效学的基础，是新药开发的重要来源[1-3]。北豆根(RhizomaMenispermi)是防己科植物蝙蝠葛的干燥根茎，具有清热解毒、祛风止痛之功效，其单方制剂北豆根片、北豆根胶囊主要用于治疗咽喉肿痛、扁桃体炎和慢性支气管炎等疾病[4]。据报道，北豆根还具有抗肿瘤作用，生物碱成分是其发挥抗肿瘤作用的活性组分[5-8]。

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一种跨膜糖蛋白，EGFR家族通过激活一系列重要的细胞过程，包括细胞分裂、生长、分化、代谢、黏附、运动和死亡，在细胞介导的生长因子信号转导中发挥关键作用[9]。据报道，EGFR在许多类型的癌症中都有过表达，包括头颈部、胰腺、乳腺、结肠、膀胱、肾脏、膀胱、卵巢和胶质瘤[10-16]。由于EGFR的表达与肿瘤的发生、增殖、转移及血管生成密切相关，因此EGFR已成为抗肿瘤药物研究的重要靶点[17]。

细胞膜色谱是贺浪冲教授于1996年独创的一种研究受体与药物相互作用的新型亲和色谱技术[18]，主要用于中药活性成分筛选、药物受体相互作用和中药注射液质量控制等[19-24]。SNAP-tag是一种蛋白标签，其无论在体内还是体外，都可特异性并快速与其配体苯甲基鸟嘌呤发生反应，以共价键结合，主要应用于胞内标记、蛋白纯化和蛋白固定等领域[25-28]。为提高细胞膜色谱柱的质量，我们在前期工作中用SNAP-tag技术制备了一种新型的EGFR胞内端朝外SNAP-tag-EGFR/CMC模型，提高了细胞膜色谱柱的稳定性和筛选的特异性[29]。本研究将该模型用于靶向筛选中药北豆根中EGFR的潜在抗肿瘤活性成分并研究药物受体的相互作用。

1 仪器与试药

1.1 仪器

HPLC-IT-TOF-MS液相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司，配有LC-20AD色谱泵2台、SIL-20AC自动进样器、CBM-20A控制器、CTO-20A柱温箱、SPD-M20A二极管阵列检测器、LCMS-IT-TOF质谱仪、电喷雾离子源和LCMS Solution工作站)。

1.2 试药

氨基键合的硅胶为填充剂(博纳艾杰尔科技公司)；北豆根购自中药材市场，经西安交通大学药学院牛晓峰教授鉴定为防己科植物蝙蝠葛(MenispermumdauricumDC.)的干燥根茎；蝙蝠葛碱(批号JOT-10324，质量分数≥98%，成都普菲德生物技术有限公司)；蝙蝠葛苏林碱(批号DST200520-024，质量分数≥98%，成都普菲德生物技术有限公司)；CCK8试剂盒(上海陶素生化科技有限公司)。

2 方法

2.1 条件

一维条件：SNAP-tag-EGFR/CMC柱(10 mm×2.0 mm, 5 μm)；流动相为50 mmol·L-1pH 7.4的磷酸氢二钠溶液；柱温为37 ℃；流速为0.2 mL·min-1；进样量为5 μL；检测波长为282 nm。二维条件：色谱柱为岛津Shim-pack GISS-HP C18色谱柱(150 mm × 3.0 mm, 3.0 μm)；流动相A为体积分数0.05%的三乙胺水溶液，流动相B为乙腈；流速为0.3 mL·min-1；梯度洗脱程序为0～60 min，20%～60% B；进样量为5 μL，二极管阵列检测器。

MS条件：离子化模式为电喷雾电离，雾化气和干燥气均为高纯氮气(N2，体积分数>99.999%)，雾化气流速为1.5 L·min-1，干燥气压力为109 kPa，曲线脱溶剂管线(CDL)温度为200 ℃，加热模块温度为200 ℃，接口电压为4.5 kV，检测电压为1.57 kV，碰撞诱导裂解(CID)气为高纯氩气(Ar，体积分数>99.999%)，CID能量为50%，正负离子扫描模式，扫描范围为m/z50～1 000。

2.2 溶液的制备

将蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱对照品均配制成1 mg·mL-1的储备液，待分析时用甲醇稀释至适宜质量浓度。

北豆根供试品的制备：称取0.3 g北豆根粉末，用50 mL甲醇超声提取1 h，减压蒸馏得到北豆根总提取物，分析时用甲醇溶解，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，得供试品溶液。

2.3 SNAP-tag-EGFR细胞膜色谱柱制备

细胞膜色谱柱制备方式与前期制备方式相同[29]。用胰蛋白酶将SNAP-tag-EGFR HEK293细胞消化，并用PBS(pH 7.4)洗涤2次。将5 mL Tris-HCl(pH 7.4)加入细胞悬液中，并用超声波细胞粉碎机破碎细胞，其参数设置为：功率为200 W，每次工作3 s后停2 s，重复工作8次。然后将混悬液离心(1 000 r·min-1，10 min)。取上清液以12 000 r·min-1离心20 min得到细胞膜。然后将细胞膜重悬于5 mL PBS中，并缓慢添加到0.04 g苯甲基鸟嘌呤修饰的硅胶固定相中。并于37 ℃震荡(1 500 r·min-1)孵育30 min。用PBS漂洗3次，洗去未反应的细胞膜。用湿法装柱得到SNAP-tag-EGFR细胞膜色谱柱。

2.4 SNAP-tag-EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF-MS二维联用系统筛选北豆根提取物中的活性组分

将北豆根提取物进样5 μL至SNAP-tag-EGFR/CMC与HPLC-IT-TOF-MS二维在线联用系统中，使第一维SNAP-tag-EGFR/CMC柱上保留组分通过富集柱的富集和十通切换阀的切换，进入第二维HPLC-IT-TOF-MS系统中进行进一步的分离及结构分析、鉴定，得到一维保留组分的具体化学结构信息。为进一步验证二维在线联用系统“识别”-“分析”-“鉴定”结果的可靠性，使被识别组分的混合对照品进入SNAP-tag-EGFR/CMC与HPLC-IT-TOF-MS二维在线联用系统中进行进一步的验证。

2.5 计算机模拟分子对接实验

为进一步验证潜在活性成分与EGFR(PDB ID:2ITY)的受体-抑制剂结合作用，用SYBYL-X2.0程序进行分子对接分析。从PDB.org下载EGFR的结构文件，去除水分子和共晶配体，在蛋白质中加入氢。用Sybyl/Sketch模块构建蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱的三维结构，并用Powell方法进行优化。

2.6 前沿分析

用前沿分析法研究蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱与EGFR相互作用力的大小。流动相A为50 mmol·L-1磷酸氢二钠(pH7.4)；流动相B为含有不同浓度药物的50 mmol·L-1磷酸氢二钠(pH 7.4)；流速为0.2 mL·min-1；柱温为37 ℃。先用A相平衡SNAP-tag-EGFR/CMC柱1 h，再将最低浓度的待测药物溶液作为流动相连续进样，形成突破曲线达到平台后停止，换用A相缓冲液继续平衡SNAP-tag-EGFR/CMC柱，待达到平衡后再进行该药物的下一个浓度的分析，分别获得0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 μmol·L-1条件下的待测药物的突破曲线，待测药物的KD值由公式(1)获得。

(1)

mLapp：在给定的摩尔浓度的配体条件下，达到突破曲线的中点所需的配体的摩尔数(mol)；

[A]：流动相中配体的浓度(mol·L-1)；

mL：细胞膜色谱柱上的结合受体的总摩尔数(mol)；

KD：平衡解离常数(mol·L-1)。

根据公式(1)，以1/mLapp对1/[A]作图呈良好的线性关系，回归曲线截距的导数为CMC柱上的结合受体的总摩尔数mL，斜率和截距的比值为平衡解离常数KD值。

2.7 细胞增殖抑制实验

用CCK-8试剂盒，按照说明书对用SNAP-tag-EGFR/CMC模型筛选出的活性成分的效果进行评价。将密度为1.5×104细胞·孔-1的细胞接种于96孔板中。培养24 h后，用不同浓度(5、25、50、100 μmol·L-1)的蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱处理细胞48 h，用含10 μL CCK-8试剂盒溶液的无血清培养基代替培养基，在37 ℃下孵育2 h。用微孔板吸光度读取器在450 nm处读取吸光度。

3 结果

3.1 北豆根中目标组分筛选

北豆根提取物样品经SNAP-tag-EGFR/CMC与HPLC-IT-TOF-MS二维在线联用系统分析，结果见图1。图1A为北豆根提取物在SNAP-tag-EGFR/CMC柱上的色谱图，包含保留组分R1和非保留组分R0；图1B为北豆根提取物直接进入HPLC-IT-TOF-MS的色谱图；将保留组分R1富集切换进入HPLC-IT-TOF-MS系统进一步的分离得到2个组分，见图1C；通过对质谱数据进行分析，推测保留组分可能为蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱，图1D为蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱的结构式。

为验证上述筛选结果的准确性，用同样的方法对蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱混合对照品溶液进行分析。结果见图2，蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱混合对照品与北豆根提取物的保留组分R1具有相同的保留行为和质谱图谱。因此，我们确定北豆根中潜在活性成分为蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱。

3.2 前沿分析法评价活性成分与EGFR的亲和强度

药物-受体相互作用与药物的体内作用机制研究以及药效评价密切相关，因此用SNAP-tag-EGFR/CMC模型结合前沿分析法研究活性成分与EGFR的亲和强度。图3为SNAP-tag-EGFR/CMC前沿分析法测得蝙蝠葛苏林碱和蝙蝠葛碱的代表性突破曲线和回归曲线，可见蝙蝠葛苏林碱(图3A)和蝙蝠葛碱(图3C)的突破曲线达到平台期的时间点均随着各自浓度的增加而缩短(突破曲线左移)。由蝙蝠葛苏林碱(图3B)和蝙蝠葛碱(图3D)的回归曲线计算得到蝙蝠葛苏林碱和蝙蝠葛碱与EGFR相互作用的KD值分别为2.48×10-6、3.57×10-6mol·L-1，证明蝙蝠葛苏林碱和蝙蝠葛碱与EGFR均存在一定强度的相互作用，这与蝙蝠葛苏林碱和蝙蝠葛碱在SNAP-tag-EGFR/CMC模型上的保留时间一致。见图4。

注：A.北豆根提取物的SNAP-tag-EGFR细胞膜色谱图；B.北豆根提取物直接进样HPLC-IT-TOF-MS的色谱图；C.保留组分R1经过富集切换的HPLC-IT-TOF-MS色谱图；D.蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱的结构式；1.蝙蝠葛碱；2.蝙蝠葛苏林碱。

注：A.蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱混合对照品溶液在SNAP-tag-EGFR/CMC柱上的保留行为；B.蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱混合对照品溶液直接进样在HPLC-IT-TOF-MS系统上的色谱图；C.保留组分R1经过富集切换在HPLC-IT-TOF-MS系统上的色谱图；1.蝙蝠葛碱；2.蝙蝠葛苏林碱。

注： A.蝙蝠葛苏林碱在SNAP-tag-EGFR/CMC的突破曲线；B.蝙蝠葛苏林碱在SNAP-tag-EGFR/CMC的回归曲线；C.蝙蝠葛碱在SNAP-tag-EGFR/CMC的突破曲线；D.蝙蝠葛碱在SNAP-tag-EGFR/CMC的回归曲线；药物浓度分别为1×10-7、2×10-7、3×10-7、4×10-7、5×10-7、6×10-7、7×10-7、8×10-7、9×10-7 mol·L-1(从下到上)，(n=3)。

图4 蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱在SNAP-tag-EGFR/CMC柱上的保留行为

3.3 分子对接模拟活性成分与EGFR的相互作用

分子对接能够呈现蛋白质-配体的作用位置及作用力类型，也能体现蛋白质复合物的结构及结合位点，我们用分子对接研究蝙蝠葛苏林碱和蝙蝠葛碱与EGFR之间的相互作用。对接的通道模式研究表明，蝙蝠葛碱(图5C)和蝙蝠葛苏林碱(图5D)均可以进入球形空间模型中EGFR的活性口袋。如带状模型所示，蝙蝠葛碱(图5A)与ASP800形成1个氢键。蝙蝠葛苏林碱(图5B)与MET793和GLN791形成2个氢键，表明北豆根中的活性组分蝙蝠葛苏林碱和蝙蝠葛碱可与EGFR发生相互作用，为CMC靶向药物活性组分筛选提供依据。见图5。

注：A.蝙蝠葛碱与EGFR对接的带状模式；B.蝙蝠葛苏林碱与EGFR对接的带状模式；C.蝙蝠葛碱与EGFR对接的通道模式；D.蝙蝠葛苏林碱与EGFR对接的通道模式。

3.4 细胞增殖抑制实验

我们用CCK8法检测了蝙蝠葛苏林碱和蝙蝠葛碱对SNAP-tag-EGFR/HEK293细胞生长的潜在抑制作用。结果见图6，当蝙蝠葛碱的浓度分别为5、25、50、100 μmol·L-1时，对SNAP-tag-EGFR/HEK293细胞生长的抑制率分别为5.18%±7.64%、43.09%±8.04%、80.59%±3.74%、83.83%±3.66%。当蝙蝠葛苏林碱的浓度分别为5、25、50、100 μmol·L-1时，对SNAP-tag-EGFR/HEK293细胞生长的抑制率分别为7.38%±12.98%、40.90%±1.65%、73.70%±6.93%、86.40%±2.43%。在5～100 μmol·L-1的范围内，蝙蝠葛苏林碱和蝙蝠葛碱对SNAP-tag-EGFR/HEK293细胞的抑制作用具有明显的剂量依赖性。因此，蝙蝠葛苏林碱和蝙蝠葛碱可作为候选抗肿瘤化合物进行进一步研究。

4 讨论

由于中药组成成分复杂，发挥治疗作用的活性成分不明确，因此，用多种方法分离分析中药及其复方中的活性成分一直是中药防治疾病研究中一个有待解决的关键问题。细胞膜色谱为中药活性成分的筛选研究提供了一种新的途径。将CMC与HPLC-IT-TOF-MS构成二维联用系统可实现对中药活性组分的识别、筛选和鉴定。

图6 蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱对SNAP-tag-EGFR/HEK293细胞的增殖抑制作用 (n=3)

用EGFR胞内区朝外的SNAP-tag-EGFR/CMC模型与HPLC-IT-TOF-MS构成二维联用系统，筛选得到作用于EGFR的活性组分蝙蝠葛苏林碱和蝙蝠葛碱，可作为候选抗肿瘤化合物进行进一步的研究。该色谱模型为研究中药及其复杂体系活性成分靶向高效筛选与评价提供新方法，为受体-配体相互作用分析提供了一个强大的平台。