熊果酸对妊娠期糖尿病大鼠胰岛素抵抗的作用

张 艺，朱 燕，南 燕

1.郑州市第七人民医院妇产科，郑州 450000；2.新乡医学院第三附属医院妇产科，新乡 453003

妊娠期糖尿病(GDM)是一种常见且严重的妊娠并发症，多数情况下，GDM是机体发生慢性胰岛素抵抗导致胰岛β细胞功能障碍而使葡萄糖耐量受损的结果[1-2]。熊果酸是一种五环三萜类化合物，存在于自然界多种药用植物及果实中，具有抗炎、抗癌、抗糖尿病、抗氧化和抗菌等多种生物活性[3-5]。研究表明，熊果酸对糖尿病及糖尿病相关并发症有一定治疗作用[6-7]。本研究用一次性腹腔注射STZ法建立了大鼠GDM模型，旨在探究熊果酸对GDM的作用及机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

血糖仪(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司)；双板垂直电泳仪、转印电泳仪和凝胶成像仪(北京六一仪器厂)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 试药

熊果酸(质量分数>98%，美国Sigma-Aldrich公司，批号U6753)；二甲双胍(中美上海施贵宝制药有限公司，批号B14202103081)；链脲佐菌素(STZ，批号S8050))、超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(批号BC0170)、丙二醛(MDA)含量检测试剂盒(批号BC0025)、苏木精(批号H8070)、伊红(批号G1100)、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(批号T2190)，均购自北京索莱宝科技有限公司；过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒(批号：A007-1-1、A005-1-2)，均购自南京建成生物工程研究所；磷酸化磷酯酰肌醇-3-激酶(p-PI3K，批号17366)、磷酯酰肌醇-3-激酶(PI3K，批号4249)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt，批号4060)和蛋白激酶B(Akt，批号4691)，均购自美国CST公司。

1.3 动物

8周龄SPF级SD大鼠，雌性70只，雄性35只，体质量均为200～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

2 方法

2.1 建模与分组

参考邢宝恒等[8]的方法建立GDM孕鼠模型。选取未交配处于动情期的雌鼠及雄鼠以2∶1的比例同笼，次日早上9: 00检查雌鼠阴道分泌物，若镜检存在精子即确定为妊娠，将妊娠成功大鼠随机分为5组，分别为正常组、模型组、二甲双胍组、熊果酸高和低剂量组，每组14只。确定妊娠的第5天，除正常组大鼠外均腹腔注射35 mg·kg-1STZ溶液，若72 h后空腹血糖(FBG)值≥13.5 mmol·L-1，则表明GDM孕鼠模型建立成功，正常组大鼠腹腔注射等量生理盐水。

2.2 给药方法

确定妊娠的当天给药，熊果酸高、低剂量组大鼠分别灌胃100、50 mg·kg-1熊果酸，二甲双胍组大鼠灌胃200 mg·kg-1二甲双胍，模型组和正常组大鼠灌胃等量蒸馏水，每天1次，连续19 d。

2.3 检测指标与方法

2.3.1样本采集 给药结束后，大鼠提前12 h禁食不禁水，尾静脉采1 mL血液样本用于FBG、空腹胰岛素(FINS)和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)检测。各组孕鼠称定质量，并剖取胎鼠、称定胎盘并记录其质量，分离胰腺组织，一部分置于多聚甲醛溶液(40 g·L-1)中固定用于制作病理切片，剩余部分冻存于-80 ℃超低温冰箱中，用于细胞因子及蛋白表达检测。

2.3.2FBG及HOMA-IR检测 血糖仪检测FBG，试剂盒检测FINS，并计算HOMA-IR(HOMA-IR=FBG×FINS/22.5)。

2.3.3SOD、CAT、GSH-Px活力及MDA含量检测 取胰腺组织置于研磨器中低温匀浆，以10 000 r·min-1离心10 min取上清，严格按照试剂盒说明书步骤检测各氧化应激指标的水平变化。

2.3.4HE染色 胰腺组织固定48 h后取出，脱蜡至水，制作厚度为4 μm的石蜡组织切片，进行常规HE染色、封片，在光镜下观察胰腺组织病变。

2.3.5TUNEL染色 取2.3.4中制作的石蜡组织切片，按照TUNEL检测试剂盒说明书步骤进行染色、封片，置于荧光显微镜下观察胰腺组织中细胞凋亡情况，计算细胞凋亡指数(AI)，AI=(凋亡细胞数/胰岛细胞总数)×100%。

2.3.6Western blot 取胰腺组织置于研磨器中匀浆，加入RIPA和PMSF提取组织蛋白，BCA法测定蛋白质量浓度，将蛋白作变性处理后进行SDS-PAGE电泳，湿转至PVDF膜，封闭2 h，4 ℃孵育p-PI3K(1∶1 000)、PI3K(1∶1 000)、p-Akt(1∶800)和Akt(1∶800)一抗稀释液，过夜后洗膜，37 ℃孵育二抗(1∶1 000)，再次清洗后滴加发光试剂，放入凝胶成像仪中成像，Image J软件对各个目的蛋白灰度值进行量化，计算蛋白相对表达量，蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

3 结果

3.1 熊果酸对FBG、FINS及HOMA-IR的影响

模型组孕鼠FBG、HOMA-IR显著高于正常组，而FINS显著低于正常组(P<0.05)。二甲双胍组、熊果酸高、低剂量组孕鼠FBG、HOMA-IR低于模型组，FINS高于模型组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠FBG、FINS及HOMA-IR水平比较

3.2 熊果酸对孕鼠、胎鼠和胎盘质量的影响

模型组孕鼠体质量、胎鼠和胎盘质量均显著高于正常组(P<0.05)。二甲双胍组、熊果酸高、低剂量组孕鼠体质量、胎鼠和胎盘质量均显著低于模型组(P<0.05)。见表2。

表2 各组孕鼠、胎鼠和胎盘质量比较

3.3 熊果酸对胰腺活力的影响

模型组孕鼠胰腺SOD、CAT及GSH-Px活力较正常组显著降低，MDA含量较正常组显著升高(P<0.05)。二甲双胍组、熊果酸高剂量及低剂量组孕鼠胰腺SOD、CAT及GSH-Px活力与模型组比较有所提高，MDA含量则低于模型组(P<0.05)。见表3。

表3 各组孕鼠氧化应激指标比较

3.4 熊果酸对胰腺组织病变的影响

HE染色显示，正常组孕鼠胰岛组织结构正常、完整，胰岛细胞排列整齐，分布均匀。模型组孕鼠的胰岛组织损伤明显，可见细胞排列紊乱、稀疏，边界不清，数量减少，有炎症细胞浸润。用药物干预后，二甲双胍组、熊果酸高及低剂量组胰岛组织损伤得到改善，组织结构均匀、整齐，细胞数量增加，细胞核和细胞质清晰可见，炎症浸润现象减轻。见图1。

注：A.正常组；B.模型组；C.二甲双胍组；D.熊果酸高剂量组；E.熊果酸低剂量组。

3.5 熊果酸对胰岛细胞凋亡的影响

由TUNEL染色结果可见，正常组孕鼠胰岛组织偶见凋亡细胞，模型组孕鼠胰岛组织中则可见大量的凋亡细胞，AI指数明显升高(P<0.05)，使用药物干预后，二甲双胍组、熊果酸高及低剂量组胰岛组织中的凋亡细胞明显减少，AI指数降低(P<0.05)。见图2、表4。

注：A.正常组；B.模型组；C.二甲双胍组；D.熊果酸高剂量组；E.熊果酸低剂量组。

表4 各组孕鼠胰岛细胞凋亡情况比较

3.6 熊果酸对胰腺组织相关蛋白表达的影响

Western blot结果显示，模型组胰腺组织PI3K、Akt蛋白磷酸化水平低于正常组(P<0.05)。用药物干预后，二甲双胍组、熊果酸高、低剂量组胰岛组织PI3K、Akt蛋白磷酸化水平较模型组有明显升高(P<0.05)。见图3、表5。

注：A.正常组；B.模型组；C.二甲双胍组；D.熊果酸高剂量组；E.熊果酸低剂量组。

表5 各组孕鼠胰腺组织蛋白表达比较

4 讨论

GDM是妊娠期常见的代谢并发症之一，患有GDM的女性在晚年发生糖尿病和心血管疾病的风险比正常女性高[9-10]。GDM患者后代患巨大儿、新生儿低血糖、高胆红素血症及新生儿呼吸窘迫综合征以及儿童期肥胖和成年期心血管疾病的风险亦显著增加[11]。GDM的发病与胰岛素抵抗密切相关，高胰岛素抵抗的GDM患者具有更加不良的代谢，也具有更高的不良妊娠结局风险[12]。本研究通过腹腔注射STZ建立了GDM大鼠模型，检测结果显示，模型组孕鼠的FBG、HOMA-IR显著升高，而FINS显著降低，且孕鼠体质量、胎鼠和胎盘质量均显著升高，病理切片染色结果显示胰岛组织损伤明显，凋亡细胞增加，表明孕鼠GDM模型建立成功，存在胰岛素抵抗和胰岛组织受损。

熊果酸是一类具有多种药理学活性的五环三萜类化合物。阮勇等[13]研究发现，熊果酸可降低糖尿病大鼠的血糖、血脂水平，并能改善肝肾功能。BACANLI M等[14]研究发现，熊果酸可显著改善糖尿病大鼠引起的肾损伤。在本研究中，经过熊果酸干预后，孕鼠FBG、HOMA-IR降低，FINS升高，孕鼠体质量、胎鼠和胎盘质量降低，表明熊果酸可改善GDM孕鼠胰岛素抵抗，减轻GDM相关肥胖及胎儿超重。HE染色显示，熊果酸改善了胰岛组织损伤，并减轻炎症浸润，TUNEL染色也显示，胰岛细胞凋亡减少，表明熊果酸可改善GDM导致的胰岛损伤和炎症浸润。正常的葡萄糖稳态需要大量健康且功能正常的胰腺β细胞来维持，氧化应激通过多种分子机制损害β细胞功能，减少胰岛素的产生，诱导胰腺细胞的凋亡过程，导致胰岛β细胞死亡和数量减少，加重胰岛素抵抗[15-18]。在本研究中，模型组孕鼠胰腺SOD、CAT及GSH-Px活力显著降低，MDA含量显著升高，用熊果酸处理后，孕鼠胰腺SOD、CAT及GSH-Px活力有所提高，MDA含量降低，表明熊果酸可减轻GDM诱导的氧化应激损伤。

PI3K/Akt信号通路存在于体内各个器官，在多种生理功能中发挥着重要作用[19]。在生理条件下，饭后分泌的胰岛素激活PI3K/Akt信号通路，增加葡萄糖利用量，减少肝脏和肌肉中的糖异生，调节脂质和葡萄糖代谢平衡，PI3K/Akt通路的激活可减轻肥胖和胰岛素抵抗[20]。而在肥胖和Ⅱ型糖尿病中，胰岛素介导的PI3K/Akt通路被阻断，减少了胰岛素分泌，降低胰岛β细胞功能，并影响着其他组织进一步加剧了胰岛素抵抗[21-22]。在本研究中，模型组孕鼠胰腺组织PI3K、Akt蛋白磷酸化水平降低，经过熊果酸处理后，与模型组比较，GDM孕鼠胰岛组织PI3K、Akt蛋白磷酸化水平升高，表明熊果酸可能通过激活PI3K/Akt信号通路改善GDM大鼠胰岛素抵抗。

综上所述，熊果酸可改善GDM孕鼠胰岛素抵抗和胰岛组织损伤，降低GDM孕鼠体质量、胎鼠和胎盘质量，减轻氧化应激，其机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关。