甘蓝型油菜BnMAPK1超量表达及中油821的转录差异表达分析

王 珍 张晓莉 刘 淼 姚梦楠 孟晓静 曲存民,2 卢 坤,2 李加纳,2,* 梁 颖,2,*

甘蓝型油菜超量表达及中油821的转录差异表达分析

王 珍1,2,**张晓莉1,**刘 淼3姚梦楠4孟晓静1曲存民1,2卢 坤1,2李加纳1,2,*梁 颖1,2,*

1西南大学农学与生物科技学院 / 油菜工程研究中心, 重庆 400715;2西南大学现代农业科学研究院, 重庆 400715;3贵州大学农业生物工程研究院 / 山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室, 贵州贵阳 550025;4江苏沿江地区农业科学研究所 / 南通市农业科学研究院, 江苏南通 210014

甘蓝型油菜(L.)是我国重要的油料作物之一, 具有较高的产量及营养价值。挖掘油菜广谱抗逆基因并深入探究其分子机制, 对提高油菜抗逆性且保证产量及品质具有重要意义。MAPK级联(Mitogen-activated protein kinase cascades)是多种信号跨膜传递的交汇点, 参与生长发育、生物及非生物胁迫应答等生物学过程。为了解甘蓝型油菜基因的生物学功能, 本研究以超量表达(OE)和中油821 (CK)油菜为材料进行数字基因表达谱分析。结果显示, 与CK相比, 650个基因在OE油菜中差异表达; 其中上调表达基因243个, 下调表达基因407个。GO注释共富集到生物学过程118条途径, 其中18条与光合作用相关(包含77个差异表达基因); 分子功能7条途径, 包括草酸氧化酶活性、锰离子结合、氧化还原酶活性等; 细胞组分38条途径, 包括叶绿体、质体、类囊体等。KEGG分析结果表明,参与调控油菜光合作用、碳代谢、次生代谢物生物合成等14条过程。此外, 利用实时荧光定量PCR验证8个候选基因在OE和CK油菜中的表达, 其表达变化与测序结果基本一致。本研究结果为甘蓝型油菜在生长发育及光响应等生物学过程中的功能分析奠定了基础, 也为农作物广谱抗逆遗传育种提供了理论依据。

甘蓝型油菜;; 差异表达基因(DEGs); 光合作用; 数字基因表达谱测序(DGE-seq)

油菜作为可食用叶类蔬菜及油用作物, 也用于花卉观赏、生物燃料和动物饲料等, 分布在全球不同气候地区[1]。全球油菜四大主产区为中国、加拿大、印度次大陆及德国、法国、英国等欧洲产区, 我国是世界第一的油菜种植大国, 种植面积和总产量均已接近世界三分之一(FAOSTAT 2020; http://faostat.fao.org/), 在农业生产中占据举足轻重的地位。与白菜型油菜()和芥菜型油菜()相比, 甘蓝型油菜()在植株的抗性和产量等方面都具有明显的优势, 是我国广泛种植的栽培种[2]。由于全球气候的变化以及栽培方式的改变, 连续阴雨天气导致的播栽推迟、越冬季节遭遇低温和干旱叠加灾害、光照不足及病虫草害频发等问题, 正在严重制约着国民经济和油料产业的发展[3-5]。随着绿色革命的发生, 育种目标从单一高产转向优质高抗高产等复合性状目标, 使得培育减投增效和减损促稳的作物新品种成为保障我国粮油供给的重大需求[6]。然而, 作物产量、品质和生物与非生物抗逆性等重要农艺性状是由多个数量位点控制, 并且不同性状之间存在连锁性与模块化调控[7-9]。因此, 挖掘油菜农艺性状形成的枢纽基因并解析其调控机理对油菜广谱抗性新品种的培育具有重要的理论意义。

MAPK级联(Mitogen-activated protein kinase cascades)是存在于所有真核生物中的保守信号转导途径, 参与植物的生长发育、生物和非生物胁迫应答过程, 包括病虫害、低温、高温、干旱、紫外线等[10-14]。经典的MAPK级联由3种激酶组成, 包括上游MEKKs (MAPK kinase kinases)与MKKs (MAPK kinases)模块和下游MAPKs模块[15]。植物在感知到刺激信号后, MAPK级联将信号逐级传递并放大, 进而通过下游的转录因子、生物酶以及结构蛋白等行使功能[13,16-17]。下游MAPKs模块根据其保守TXY基序(磷酸化位点)被分为A-group～D-group, A-group～C-group为TEY基序, D-group为TDY基序; 其中, MAPK3/6/10属于A-group, MAPK4/5/11/12/13属于B-group, MAPK1/2/7/14属于C-group, MAPK8/9/15/16/17/ 18/19/20属于D-group[14]。

目前, MAPKs模块的研究主要集中在A-group MAPK3/6和B-group MAPK4。研究报道, A-group MAPK3/6在拟南芥()、番茄()和水稻()等多种植物中均被发现与环境和激素应答相关, 包括响应盐胁迫、损伤、茉莉酸(jasmonic acid, JA)、水杨酸(Salicylic acid, SA)等[18-20]。拟南芥AtMAPK3/6通过MAPK级联(AtMEKK1-AtMKK4/5- AtMAPK3/6)调控下游AtWRKY22/29转录因子, 进而有效抵御细菌()和真菌()的侵害[21]。B-group AtMAPK4能够与AtMKS1 (MAPK substrate 1)和AtWRKY33结合形成复合体, 调控植保素(Camalexin)的生物合成参与防御反应[22]。此外, AtMAPK4还被报道通过MAPKs级联参与渗透、干旱、冷害、盐害胁迫应答以及雄性特异性减数分裂胞质分裂过程[23-26]。C-group MAPKs被报道可能主要在植物的非生物胁迫应答过程中起调控作用。研究表明, 拟南芥AtMEKK17/18- AtMKK3-AtMAPK1级联受到PYR/PYL/RCAR-SnRK2- PP2C (Pyrabactin resistance/Pyrabactin resistance-like/ Regulatory component of ABA receptor-SNF1-related protein kinases 2-Protein phosphatases 2C)复合体的激活而响应ABA[27]。AtMKK3-AtMAPK1-AtRBK1 (Rho-like GTPases from plants-binding kinase 1)级联通过生长素信号途径参与细胞扩张过程[28]。此外, MAPK1还被报道在拟南芥及豌豆()中响应H2O2, 正向调控种子萌发过程[29-31]。与A-group～C-group不同的是, D-group MAPKs为植物特有, 可不依赖于经典的MAPKs级联途径行使功能[32]。研究发现, 玉米参与ABA、SA、JA、低温、渗透、病原体等多种外源信号分子和胁迫应答[33]。番茄通过糖和生长素代谢与信号传递而特异性调节减数分裂后的花粉发育过程[34]。这些研究表明, 植物是具有广谱抗逆性的保守基因。因此, 甘蓝型油菜基因的生物学功能研究对油菜广谱抗性品种的选育具有重要意义。

本课题组前期分别对拟南芥、芥菜()、黑芥()、甘蓝()、白菜()以及甘蓝型油菜的MAPKs基因家族进行比对分析, 在甘蓝型油菜中获得29个基因(C-group包含5个基因), 其中(同源基因)在不同生长时期及不同组织器官中均有表达, 并且能够响应JA、ABA、H2O2、损伤、核盘菌()、干旱及弱光胁迫诱导[35-36]。我们前期以BnMAPK1为诱饵, 通过酵母双杂交文库筛选发现BnMAPK1可能参与多种激素信号途径、生物与非生物胁迫应答、光合作用、次生代谢物的生物合成与代谢等生物学过程[37]。目前, 对下游MAPKs模块的研究主要通过上游MEKKs和MKKs模块与下游MAPKs模块之间的相互作用进行功能分析, 受限于该级联的逐级激活, 对C-group的生物学功能还知之甚少。本试验以不依赖于MAPK级联上游模块的超量表达转基因油菜及其受体为材料, 利用数字基因表达谱测序(digital gene expression profiling sequencing, DGE-seq)技术对调控的差异表达基因进行筛选及分析, 以深入解析在甘蓝型油菜中的基因功能、下游应答因子及其调控途径。本研究为逐步完善甘蓝型油菜的分子功能奠定基础, 同时也为MAPK级联在油菜优质高抗高产品种改良中的应用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料超量表达转基因油菜(OE)及对照受体材料中油821 (CK)由重庆市油菜工程技术研究中心提供[38]。()的开放阅读框(open reading frame, ORF)通过限制性内切酶I和I连接至pCAMBIA2301M超量表达载体后, 遗传转化至CK中。取饱满一致的T3世代OE及CK种子, 播种于直径12 cm的花盆中。待真叶长出后, 对转基因植株进行阳性鉴定。首先, 每株植株选取一片真叶涂刷300 mg L-1Basta, 3 d后观察叶片是否黄化。随后, 选取无黄化的植株提取叶片DNA, 分别使用35S-F+OCS-R和Bar-F+Bar-R引物检测和(Basta抗性基因)的插入。对PCR条带正确的植株进一步提取RNA, 分别使用BnMAPK1- qF+BnMAPK1-qR和BnACT7-F+BnACT7-R引物进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测和内参基因()的表达水平(引物序列见表1)。检测后的阳性植株每盆定苗3株, 种植于人工气候光照培养箱(Conviron, 加拿大)。光照及温度条件设置为16 h光照(25℃)/8 h黑暗(16℃), 光照强度800 µmol m−2s−1, 湿度50%～60%。分别选取1月龄(4～5叶)苗期健康且长势一致的OE和CK组植株各6株, 每组材料中每3棵植株的第2～3片真叶取样作为混合样本, 迅速放入液氮中冷冻, 贮存于−80℃超低温冰箱备用, 用于总RNA的提取。

1.2 甘蓝型油菜叶片总RNA的提取、DGE-seq文库构建与测序

采用TRIzol Reagent (Thermo Fisher Scientific, 美国), 参照说明书提取甘蓝型油菜叶片总RNA, 并检测RNA的完整性、浓度及纯度。无明显降解和污染的RNA样品委托上海美吉生物医药科技有限公司进一步评估RNA质量。检测合格的RNA样品用于DGE-seq文库构建及测序。使用Oligo(dT)磁珠(Thermo Fisher Scientific)富集分离mRNA。随后采用Truseq RNA sample prep Kit (Illumina, 美国)将mRNA打断, 以短片段mRNA为模板合成双链cDNA并纯化, 末端补平后, 3¢端加A并连接接头。然后进行PCR扩增及纯化, 使用TBS380和Agilent 2100对富集的文库进行定量、稀释及质量检测。最后采用Truseq PE Cluster Kit v3-cBot-HS (Illumina)对合格的文库进行桥式扩增生成clusters, 利用Illumina HiSeq平台进行测序。原始数据(Raw data)已上传至NCBI (National Center for Biotechnology Information) SRA (Sequence Read Archive)数据库(BioProject ID: PRJNA595447; Accession ID: SRR10681566, SRR10762584, SRR10681565, SRR10681567)。

表1 转基因植株鉴定和差异表达基因验证所用引物

1.3 DGE-seq数据处理及差异表达基因分析

DGE-seq的Raw data使用FastQC (http://www. bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)和BBTools- BBDuk (https://jgi.doe.gov/data-and-tools/bbtools/)进行质控, 获得Clean data。以Genoscope数据库甘蓝型油菜为参考基因组(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/), 分别采用StringTie[39]和HISAT2[40]对Clean data进行序列组装拼接和mapping比对。通过DESeq2 RLE (Relative Log Expression)算法[41]对比对结果进行归一化、统计分析及差异表达(OE vs. CK)鉴定。为保证差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)的分析质量, 剔除在一组材料中的FPKM (Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments)值均为0的基因, 筛选阈值设置为adj<0.05和|log2Fold Change |>1。使用TBtools[42]对DEGs在OE及CK各植株中的表达进行可视化展示, 根据DEGs进行均一化分析及聚类分析; 热图颜色为各DEGs的表达情况, 以log2(FPKM+1)均一化数值表示。

1.4 差异表达基因的GO和KEGG pathway富集分析

利用GOstats平台[43]对DEGs进行GO (Gene Ontology)和KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) pathway显著性富集分析。按照生物学过程、分子功能和细胞组分三大类别对DEGs进行GO注释和富集分析, 阈值设置为adj<0.05。GO富集以柱状图进行可视化展示, X轴和Y轴分别表示GO Term名称和富集显著性。根据代谢通路对KEGG pathway进行分类和富集分析, 阈值设置为value<0.05。KEGG pathway使用R软件包对各信号通路的DEGs富集进行可视化展示, X轴和Y轴分别表示富集显著性和通路名称, 气泡大小和颜色分别表示富集基因数量和富集因子(该代谢通路中富集的DEGs数量占该通路所有注释基因总数的百分比)。

1.5 候选DEGs的表达模式分析及实时荧光定量PCR (qRT-PCR)验证

结合GO和KEGG pathway富集分析, 筛选相关生物学途径及其对应DEGs。根据本研究中心前期甘蓝型油菜中油821苗期逆境RNA-Seq数据(NCBI Database, BioProject ID: PRJNA680826), 对候选基因在苗期正常生长(Mock)及弱光(Shading)处理条件下的表达模式进行比较分析。根据前期甘蓝型油菜中双11品种各生长时期与组织器官的RNA-Seq数据(National Genomics Data Center, BioProject ID: PRJCA001246)[44], 对候选DEGs进行时空表达模式分析, 包括种子萌发期、苗期、蕾薹期、初花期、盛花期以及下胚轴、子叶、根系、茎、叶片、主序顶端、种子。使用TBtools对DEGs的log2(FPKM+1)值均一化并进行可视化分析。

为验证DGE-seq数据及候选差异表达基因的可靠性, 采用Primer 3 (https://primer3.ut.ee/)在线工具[45]设计qRT-PCR特异引物(表1), 检测8个DEGs在OE及CK材料中的表达。根据操作手册使用TaKaRa SYBR Premix ExII Kit (Takara, 美国), 采用qTOWER2.2 quantitative real-time PCR thermal cycler system (Analytik Jena, 德国)进行qRT-PCR反应。每个样品3次重复, 内参基因为。反应程序为: 95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 45 s, 40个循环; 60℃ 45 s。反应结束后, 采用qPCR soft 3.1 system (Analytik Jena)分析Ct值, 并使用2−ΔΔCt算法[46]分析各DEGs的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 BnMAPK1超量表达与对照甘蓝型油菜的DGE-seq筛选到650个DEGs

分别采用35S-F+OCS-R和Bar-F+Bar-R引物对OE植株进行PCR鉴定, 前者产物长度约为1800 bp, 后者约为530 bp (附图1-A, B), 表明目的基因与抗性基因已整合至植物基因组中。利用qRT-PCR对CK及OE植株的相对表达量进行检测(附图1-C), 选取长势一致且表达水平接近的植株进行DGE-seq分析。将DGE-seq质控后的Clean data与甘蓝型油菜基因组进行比对, 并对所有基因在各转录本中的表达进行差异显著性分析。根据基因在各样本间的|log2Fold Change|>1及adj<0.05筛选标准, 并且同组材料中至少一个转录本的FPKM≠0, 与CK相比, 在OE转基因甘蓝型油菜中共获得650个DEGs, 其中上调与下调的DEGs分别为243、407个, 分别占总DEGs的37.38%、62.62% (图1和附表1)。表达上调与下调2～4倍的DEGs分别为91、101个, 分别占总上调与总下调DEGs的37.45%、24.82%; 表达上调与下调4～8倍的DEGs分别为73个和117个, 分别占总上调与总下调DEGs的30.04%、28.75% (附图1-D和附表1)。表明, DEGs的表达水平变化主要集中在8倍以内, 表现出高度的不均一性。

图1 BnMAPK1超量表达(OE)及对照(CK)甘蓝型油菜间的650个差异表达基因(DEGs)热图

Fig. 1 Heatmap of 650 differentially expressed genes (DEGs)between-overexpression (OE) and the control (CK) in rapeseed

热图颜色代表DEGs均一化后的log2(FPKM+1)数值, |log2Fold Change|>1且adj.< 0.05。

The color in the heatmap represents the log2(FPKM+1) value of DEGs after normalization, with |log2Fold Change|>1 andadj.< 0.05.

2.2 BnMAPK1调控甘蓝型油菜光合作用基因的表达

对650个DEGs进行GO功能注释, 分别富集到生物学过程、分子功能和细胞组分118、7和38条pathways (附表2)。其中, 生物学过程主要包括光合作用(GO:0015979)、响应蔗糖(GO:0009744)和响应细菌(GO:0009617)等; 分子功能主要包括草酸氧化酶活性(GO:0050162)、锰离子结合(GO:0030145)和氧化还原酶活性(GO:0016491)等; 细胞组分主要包括叶绿体(GO:0009507)、质体(GO:0009536)和类囊体(GO:0009579)等(图2-A和附表2)。值得注意的是, GO生物学过程共富集到18条与光合作用相关的pathways, 包括光合作用光反应(GO:0019684)、光系统II的组装(GO:0010207)和光合电子传递链(GO:0009767)等(图2-B和附表3)。其中, 与光合作用相关的DEGs共77个, 上调DEGs仅有3个(3.90%), 下调基因74个(96.10%); 这些基因主要参与光反应、光系统II、气孔复合体形态建成、光合色素、四吡咯合成及代谢、电子传递以及对蓝光、红光与远红光的响应过程(附图2和附表4)。

图2 BnMAPK1超量表达(OE)及对照(CK)甘蓝型油菜DGE-seq中DEGs的Top 10 GO注释分析(A)及光合作用相关的GO-BP途径富集分析(B)

GO分类分别为生物学过程、分子功能和细胞组分。GO:0006091表示前体代谢物和能量的产生; GO:0016623表示氧化还原酶活性, 作用于供体的醛基或氧代基团, 氧为受体; GO:0016903表示氧化还原酶活性, 作用于供体的醛基或氧代基团; GO:0003868表示4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶活性。DEGs: 差异表达基因。

GO category including biological process, molecular function, and cellular component. GO:0006091 represents the generation of precursor metabolites and energy; GO:0016623 represents the oxidoreductase activity, acting on the aldehyde or oxo group of donors, oxygen as acceptor;GO:0016903 represents the oxidoreductase activity, acting on the aldehyde or oxo group of donors; GO:0003868 represents 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase activity. DEGs: differentially expressed genes.

为进一步了解可能参与的代谢途径与信号转导过程, 对650个DEGs进行KEGG pathway富集分析。结果显示, 650个DEGs主要分布在14条KEGG pathways中, 主要包括光合作用(ko00195)、碳代谢(ko01200)和丙酮酸代谢(ko00620)等(附表5和图3)。其中, 光合作用pathway最显著, 共有9个DEGs, 它们在GO pathway中也被富集到, 这些结果表明可能在甘蓝型油菜光合作用中扮演重要角色。

2.3 BnMAPK1可能负调控甘蓝型油菜光系统与电子传递相关基因的表达

对GO和KEGG pathway均富集到的9个DEGs进一步分析发现, 它们在超量表达后均发生显著下调(表2)。9个基因分别参与光合作用pathway中光系统I、光系统II和光合电子传递过程(图4)。其中,(,)与(,)基因参与光系统I, 分别下调9.73倍和6.87倍;(,)、(,)与(,)基因参与光系统II, 分别下调8.48、5.32和3.06倍;(,,,,)基因参与光合电子传递过程, 分别下调35.79、24.12、5.72和4.01倍(表2、图4和图5-A)。表明可能参与光合作用中光系统I、光系统II与电子传递受体的表达调控。

图3 BnMAPK1超量表达(OE)及对照(CK)甘蓝型油菜DGE-seq中DEGs的Top 10 KEGG pathway富集分析

DEGs: 差异表达基因。DEGs: differentially expressed genes.

表2 BnMAPK1超量表达(OE)与对照(CK)甘蓝型油菜的候选光合作用差异表达基因列表

(续表2)

图4 BnMAPK1超量表达(OE)及对照(CK)甘蓝型油菜DEGs光合作用(ko00195)通路图

DEGs: 差异表达基因。DEGs: differentially expressed genes.

2.4 光合作用光系统I、光系统II与电子传递相关DEGs的表达模式分析

利用本课题组前期的甘蓝型油菜中油821品种正常生长与弱光处理的RNA-seq数据, 分析9个DEGs对弱光胁迫的应答模式。结果显示, 与正常生长条件相比,()成员在弱光条件下的基因表达上调, 是正常生长环境下该基因表达量的1.24倍; 其余8个DEGs的表达均下调, 是正常生长条件下基因表达量的0.30～0.91倍(图5-B)。根据本研究室甘蓝型油菜中双11品种不同组织器官及不同生长时期的RNA-seq数据, 对9个DEGs的时空表达模式进行分析。结果显示, 光系统I和电子传递受体()基因在各生长时期及各组织器官中几乎不表达; 其余7个DEGs在根系中的表达均较低, 在叶片(子叶、幼叶与成熟叶)中的表达最高, 在茎、主序顶端及幼嫩种子(Se_10d)中也有表达(图5-C)。叶片作为甘蓝型油菜光合作用的主要场所, 光合作用直接影响其生长发育、产量及抗性等过程。因此, 我们推测基因可能在光合作用途径, 尤其是光系统及电子传递过程中扮演着重要角色, 进而可能参与调控甘蓝型油菜的生长发育和光响应等过程。

图5 BnMAPK1参与甘蓝型油菜光合作用途径的候选基因的表达模式分析

A: 候选基因在DGE-seq中的差异表达; B: 候选基因在甘蓝型油菜中油821品种中的弱光应答模式; C: 候选基因在甘蓝型油菜中双11品种不同时期不同组织中的时空表达模式。Ro_48h: 种子萌发48 h根系; Ro_s: 苗期根系; Ro_b: 蕾薹期根系; Ro_i: 初花期根系; Ro_f: 盛花期根系。Hy_48h: 种子萌发48 h下胚轴; St_b: 蕾薹期茎; St_i: 初花期茎; St_f: 盛花期茎。Co_48h: 种子萌发48 h子叶; LeY_s: 苗期幼叶; LeY_b: 蕾薹期幼叶; LeY_i: 初花期幼叶; LeY_f: 盛花期幼叶。LeM_b: 蕾薹期成熟叶; LeM_i: 初花期成熟叶; LeM_f: 盛花期成熟叶。IT_i: 初花期主序顶端; IT_f: 盛花期主序顶端。Se_10d: 花后10 d种子; Se_21d: 花后21 d种子; Se_30d: 花后30 d种子; Se_40d: 花后40 d种子。热图颜色代表DEGs均一化后的log2(FPKM+1)数值, |log2Fold Change|>1且adj<0.05。

A: the differential expression level of candidate genes in DGE-seq; B: shading stress response patterns of candidate genes inZhongyou 821; C: the spatial and temporal expression patterns of candidate genes in different tissues at different stages inZhongshuang11. Ro_48h: root at 48 h after seed germination; Ro_s: root at seedling stage; Ro_b: root at bolting stage; Ro_i: root at initial bloom stage; Ro_f: root at full bloom stage. Hy_48h: hypocotyl at 48 h after seed germination; St_b: stem at bolting stage; St_i: stem at initial bloom stage; St_f: stem at full bloom stage. Co_48h: cotyledons at 48 h after seed germination; LeY_s: young leaf at seedling stage; LeY_b: young leaf at bolting stage; LeY_i: young leaf at initial bloom stage; LeY_f: young leaf at full bloom stage. LeM_b: mature leaf at bolting stage; LeM_i: mature leaf at initial bloom stage; LeM_f: mature leaf at full bloom stage. IT_i: tip of main inflorescence at initial bloom stage; IT_f: tip of main inflorescence at full bloom stage. Se_10d: seed at 10 d after flowering; Se_21d: seed at 21 d after flowering; Se_30d: seed at 30 d after flowering; Se_40d: seed at 40 d after flowering. The color in the heatmap represents the log2(FPKM+1) value of DEGs after normalization, with |log2Fold Change|>1 andadj<0.05.

2.5 差异表达基因的qRT-PCR验证

为验证DGE-seq结果的准确性, 设计特异引物对超量表达及对照植株的8个DEGs进行qRT-PCR验证。采用作为内参基因, 计算8个DEGs的相对表达量。其中, 5个下调DEGs与光系统复合体及电子传递受体相关, 包括、、、和(), 在OE植株中的表达量是CK的0.10～0.33倍(图6-A～E)。3个上调DEGs与生长发育相关, 包括(,)、(,)和(,)。被报道通过生长素与ABA信号途径正向调控拟南芥的根系和花药的发育过程[47], 杂草地肤()突变后导致维管束系统发育受阻且光合作用效率显著下降[48]。CDC5作为植物、动物和真菌中保守的MYB相关蛋白, 正向调控初级mRNA的转录后加工[49]; 同时, CDS作为细胞周期调节剂, 还参与拟南芥茎尖分生组织的细胞分裂过程[50]。基因是跨冬开花植物所必需的基因,被报道可能作为负调控因子参与梅花()和番茄的开花过程[51-52]。qRT-PCR结果显示,、和基因在OE油菜中的表达量分别为CK植株的2.14、4.18和10.20倍(图6-F～H)。将qRT-PCR结果与DGE-seq数据进行比较分析, 结果如图6-I～J所示, 8个DEGs的测序表达变化趋势与qRT-PCR中的表达变化结果基本一致, 同时DGE-seq数据与qRT-PCR结果一致性高(2=0.9686), 表明DGE-seq数据的可靠性, 可以用来分析在甘蓝型油菜中的基因功能。

图6 BnMAPK1超量表达(OE)及对照(CK)甘蓝型油菜DGE-seq中DEGs的qRT-PCR验证结果

A～H: 8个DEGs的相对表达量; I: 8个DEGs在DGE-seq中的差异表达倍数; J: 8个DEGs qRT-PCR与DGE-seq的相关性分析。DEGs: 差异表达基因。

A–H: the relative expression levels of eight DGEs; I: the differential expression folds of eight DEGs in DGE-seq; J: the correlation between qRT-PCR and DGE-seq of eight DEGs. DEGs: differentially expressed genes.

3 讨论

MAPK级联是植物调控生长发育过程、响应生物与非生物胁迫的主要信号通路[32,53-54]。下游的MAPKs模块已在拟南芥、水稻、玉米、小麦、棉花及番茄等多种植物中被鉴定, 其中C-group基因被报道参与生长素诱导的细胞扩张, 响应损伤、JA、ABA、SA、ROS、H2O2及盐胁迫等[27-29,32,55-58]。值得注意的是, 不同物种对相同的刺激会做出不同的应答, 且对应的信号转导途径也不相同[59]。结合前期对甘蓝型油菜BnMAPKs家族的鉴定与逆境应答模式分析以及BnMAPK1的酵母双杂交文库筛选发现,基因在多种生物与非生物胁迫应答中具有重要调控作用, 如病原菌、激素信号途径、高温、干旱、光照等[35-37]。随着高通量组学技术的不断发展及其应用成本的降低, 采用转录水平的测序已经成为快速解析基因分子功能及其下游调控基因的手段之一。本研究对超量表达转基因油菜及其对照植株进行DEG-Seq分析发现,超量表达后共有650个基因差异表达(附表1), 这些基因将为在甘蓝型油菜中的生物学功能、相关的信号途径及其分子机制的研究提供基础。

在自然界中, 光合作用是植物的能量来源, 直接决定植物的生长发育和形态建成, 是植物生物与非生物胁迫应答的基础[60]。本研究对超量表达油菜650个DEGs的GO富集分析结果显示, 这些差异基因主要集中在光合作用、响应蔗糖和细菌、前体代谢物及能量的产生、小分子代谢过程等; 77个DEGs的注释结果显示参与调控光合作用过程, 包括光合电子传递和光合结构相关的气孔复合体与色素系统等, 其中仅有3个光合相关DEGs表达上调(附表2～附表4)。在植物的光呼吸作用中, 缬氨酸通过氧化脱羧和酯化以及去饱和形成β-羟基异丁酰辅酶A (HIBYL-CoA, β-hydroxyisobutyryl-CoA), 随后经过硫酯水解与氧化等过程逐步形成丙酰辅酶A[61]。研究报道, 拟南芥()基因编码HIBYL-CoA水解酶, 参与脂肪酸β氧化、过氧化物酶体缬氨酸的分解过程和植物生长素信号途径, 并正向调控植物的耐冷性[61-62]。我们的DGE-seq数据显示, 与对照植株相比,超量表达植株中()基因的表达水平显著上调5.27倍(附表3)。因此, 推测可能在光合作用、生长发育及冷胁迫应答过程中扮演着重要角色。高等植物中, Tic20 (Translocon at the inner envelope membrane of chloroplasts 20)是叶绿体内包膜前体蛋白的易位中心, 主要负责将细胞质前体蛋白识别并转运至叶绿体基质中行使光合功能[63]。拟南芥AtTic20分为2个亚族Group1 (AtTic20-I、-IV)和Group2 (AtTic20-II、-V), Group1在拟南芥中的功能较Group2更重要; 其中AtTic20-II在光合作用及胚胎和种子发育过程具有调控作用, 但各异构体之间存在严重的功能冗余[63]。在我们的研究中,()基因在超量表达后显著上调4.38倍, 而其他3种异构体在DGE-seq中的无差异表达(附表3)。这些结果表明, 甘蓝型油菜中BnTic20不同异构体之间的功能重要性可能与拟南芥各不相同。与MAPKs相似的另一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶雷帕霉素靶蛋白TOR (Target of Rapamycin), 也是真核生物中非常保守的信号通路。胞质磷酸核糖基焦磷酸合成酶PRS4 (Phosphoribosyl diphosphate synthase 4)作为一种关键调节酶, 是促进植物TOR活性的必需基因, 在协调植物的生长发育、代谢稳态与营养供应中发挥着重要作用[64]。本研究中()基因在OE植株中显著上调表达3.81倍(附表3)。有意思的是, 光自养植物的SnRK1 (Sucrose non-fermenting-1 (SNF1)-related kinase 1)和TOR在糖信号和能量传递中是以拮抗方式调节生长发育[65], 前期研究发现可以招募BnSnRK1的PV42a亚基(BnaA06g10010D), 正向调控的转录表达, 这些数据表明甘蓝型油菜SnRK1-TOR信号网络可能与MAPKs级联途径密切相关。此外, 前期发现中包含了大量光合相关的顺式作用元件, 且的表达受到弱光胁迫的诱导[36]。表明可能在甘蓝型油菜的光合作用过程中具有重要的调控作用。

高等植物的光合作用是一个非常复杂的生物过程, 涉及光系统I、光系统II、Cyt b6/f复合体(Cytochrome b6/f complex)、ATP合成酶以及其他电子传递相关因子等[66]。DGE-seq研究发现,超量表达植株中光合相关的其他DEGs均表现为显著下调; 其中, 编码光合作用通路(ko00195)光系统I中PSAF与PSAG亚基、光系统II中PSBO、PSBY与PSBS亚基以及光合电子传递中PetF亚基的9个DEGs均下调表达(表2和图4)。研究报道, 高等植物中PSAF亚基的N段具有螺旋-螺旋模体, 使得植物的光系统I能够有效的与电子递体质体蓝素相结合, 并通过Cyt b6/f复合体保证电子传递的进程[67]。PSAG亚基是植物和绿藻所特有的, PSAG与自身的2个跨膜螺旋构成捕光复合体(LHC, light harvesting complex) I结合的表面, 同时其C端伸出的20个氨基酸为Cyt b6/f复合体提供结合表面[68]。本研究中,和基因在OE植株中显著下调, 编码光系统I电子递体铁氧还蛋白的4个基因也下调表达; 但编码光系统I其他亚基及其他电子递体如质体蓝素的相关基因均无差异表达(附表3和图4), 这表明对光系统I的调控可能主要集中在电子传递过程。

在光系统II中, 核基因编码的PSBO亚基是高等植物和蓝藻中均存在的非常保守的膜外在蛋白, 结合在类囊体腔一侧, 是光合放氧活性所必需的[69]。低分子质量膜蛋白的PSBY亚基被报道也与光系统II相联系, 可能是维持光系统II的结构完整和双体构象以及叶绿素、类胡萝卜素、脂分子的结合环境[70]。PSBS亚基也是真核光合生物所独有的蛋白, 拟南芥突变体被报道不能进行快速可逆的高能淬灭[71]。DGE-seq显示, 编码上述亚基的、与基因在OE植株中均显著下调; 并且编码外周天线蛋白LHC II中LHCB1 (Chlorophyllbinding protein 1)和LHCB4 (Light-harvesting complex II chlorophyllbinding protein CP29)亚基的()和()基因也显著下调表达(附表3)。在高等植物和一些藻类中, LHCB1与LHCB2、LHCB3组合形成三聚体, LHCB4与LHCB5、LHCB6组合形成LHC II外周天线, 在增强蛋白质稳定性、有效捕获光能和控制能量耗散上发挥重要作用[72]。因此, 我们推测对光系统II的调控可能是通过控制光系统II-LHC II超级复合体的稳定性而影响甘蓝型油菜的光合作用过程。

尽管在甘蓝型油菜光合作用中的功能还有待进一步的研究, 但这些基于DGE-seq的数据为其基因功能及其调控网络的深入研究奠定了基础, 同时也为甘蓝型油菜新种质资源的开发和应用提供了理论依据。

附图和附表 请见网络版: 1) 本刊网站http://zwxb. chinacrops.org/; 2) 中国知网http://www.cnki.net/; 3) 万方数据http://c.wanfangdata.com.cn/Periodicalzuowxb.aspx。

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Transcriptional differential expression analysis between-overexpression and Zhongyou 821 rapeseed (L.)

WANG Zhen1,2,**, ZHANG Xiao-Li1,**, LIU Miao3, YAO Meng-Nan4, MENG Xiao-Jing1, QU Cun-Min1,2, LU Kun1,2, LI Jia-Na1,2,*, and LIANG Ying1,2,*

1College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University / Chongqing Engineering Research Center for Rapeseed, Chongqing 400715, China;2Academy of Agricultural Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China;3Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region (Ministry of Education) / Institute of Agro-bioengineering College, Guizhou University, Guiyang 550025, Guizhou, China;4Jiangsu Yanjiang Institute of Agricultural Sciences / Nantong Academy of Agricultural Sciences, Nantong 210014, Jiangsu, China

Rapeseed (L.) is an important oilseed crop in China, with high yield and nutritional value. Exploring the mechanism of the broad-spectrum stress regulatory genes plays key roles for improving stress resistance, yield, and quality in rapeseed. Mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascades are the junctions of several transmembrane signaling, and are involved in a wide variety of biological processes, including growth, development, biotic, and abiotic stress responses. In order to survey the biological function ofgene in rapeseed,-overexpression (OE) and Zhongyou 821 (CK) plants were used as the experimental materials to perform the digital gene expression profiling sequencing at one-month-old seedling stage. Compared with CK, a total of 650 differentially expressed genes were obtained in OE plants, including 243 up-regulated genes and 407 down-regulated genes. GO annotation showed that differentially expressed genes were mainly enriched in 118 pathways in biological process, among which 18 pathways related to photosynthesis (with 77 differentially expressed genes). There were seven pathways in molecular function such as oxalate oxidase activity, manganese ion binding, and oxidoreductase activity; and 38 pathways in cellular component such as chloroplast, plastid, and thylakoid. KEGG indicated thatwas involved in regulating 14 pathways in rapeseed, including photosynthesis, carbon metabolism, and biosynthesis of secondary metabolites. In addition, the relative expression levels of eight candidate genes were validated by qRT-PCR in OE and CK in rapeseed, demonstrating that the expression changes of these eight genes were generally consistent with the sequencing data. Our findings lay a foundation for the function ofin growth and development and light response in rapeseed and provide a theoretical basis for genetic breeding of crop resistance.

;; differentially expressed genes (DEGs); photosynthesis; digital gene expression profiling sequencing (DGE-seq)

10.3724/SP.J.1006.2023.24073

本研究由国家自然科学基金项目(32101663, 31872876), 中国博士后科学基金项目(2021M692683), 重庆市自然科学基金项目(cstc2021jcyj-bshX0234), 重庆市博士后科研特别资助项目(2010010006157688)和高等学校学科创新引智基地项目111 (B12006)资助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (32101663, 31872876), the China Postdoctoral Science Foundation (2021M692683), the Chongqing Natural Science Foundation (cstc2021jcyj-bshX0234), the Chongqing Special Funding in Postdoctoral Scientific Research (2010010006157688), and the Project of Intellectual Base for Discipline Innovation in Colleges and Universities (the 111 Project of China) (B12006).

通信作者(Corresponding authors):梁颖, E-mail: yliang@swu.edu.cn; 李加纳, E-mail: ljn1950@swu.edu.cn

同等贡献(Contributed equally to this work)

王珍, E-mail: wangzhencq@swu.edu.cn; 张晓莉, E-mail: zhangxl806@163.com

2022-03-30;

2022-07-22;

2022-08-29.

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