几种物理因子对黄芩细胞悬浮培养的影响

杨 静 陈 娜 崔晓雪

天津渤海职业技术学院环境与化工学院 天津 300402

黄芩(Scutellaria baicalensis)又名山茶根、黄芩条等，为唇形科植物黄芩的干燥根，属多年生草本植物，是一种非常常见的传统中药[1]。黄芩主要功效有清热燥湿、消炎抗菌、抗氧化等。黄芩苷作为黄芩的主要有效成分，具有抑菌抗炎、镇静、降压、抗变态反应等药理作用，亦被作为黄芩和黄芩制剂的主要质量控制指标成分[2]。

黄芩是生产双黄连口服液、清肺排毒汤的重要中药材之一。现阶段，黄芩在国内的需求量极大，也是出口到国外最多的药材之一。利用悬浮培养技术可以人工控制营养、温度、光照等培养条件，不受病虫害、季节和地理位置的干扰，获得质量稳定的植物细胞有效成分。本文以黄芩实生苗为材料诱导出愈伤组织，通过研究物理因子对黄芩细胞悬浮培养的影响，建立黄芩细胞悬浮培养体系，为利用细胞大规模工业化生产次生代谢产物提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

黄芩种子购自河北省安国市药材市场，黄芩苷对照品购自中国药品生物制品检定所；化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器

TCYA ZYSA0351型摇床，202型电热恒温干燥箱，BCN-1360型超净工作台，Satorius BS 2202S型电子天平，UV-7500紫外分光光度计，HPG-280B强光照培养箱等。

1.3 方法

1.3.1 黄芩无菌苗的获得

取饱满的黄芩种子用75%的乙醇溶液浸泡1min，用无菌水冲洗3次，在2%的次氯酸钠溶液中进行表面消毒20min，再用无菌水冲洗5次。将消毒灭菌的种子接种于添加有0.2mg/L6-BA的MS培养基上，pH值为5.8，光照16h培养，4～5d种子萌发，20d后可得长势良好的试管苗。

1.3.2 黄芩愈伤组织的诱导

取黄芩试管苗幼嫩茎段，用自来水冲洗干净，75%的乙醇溶液消毒30s，无菌水冲洗3次，切成0.5cm左右长的小段，接种于愈伤组织诱导培养基上培养。培养条件为MS培养基，附加有1.0mg/L6-BA、2.0mg/LNAA、3%蔗糖、1%琼脂，pH值为5.8，培养条件为25±1℃，暗培养，培养大约6周后可得愈伤组织。

1.3.3 黄芩愈伤组织的增殖

挑选生长良好疏松的愈伤组织称重后进行继代培养，其培养条件同诱导培养基。继代培养3次后获得生长稳定、质地疏松的黄芩愈伤组织。

1.3.4 不同接种量对黄芩细胞悬浮培养的影响

将新鲜、疏松连续继代3次以上的绿色愈伤组织2g接种到250mL三角瓶中培养，瓶内装50mL附加1.5mg/L6-BA和0.5mg/LNAA的MS液体培养基。接种量分别为2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%，培养基pH值为5.8，摇床转速120r/min，每组重复3～4瓶。

1.3.5 光照条件对黄芩细胞悬浮培养的影响

将新鲜、疏松连续继代3次以上的绿色愈伤组织2g接种到250mL三角瓶中培养，瓶内装50mL附加1.5mg/L6-BA和0.5mg/LNAA的MS液体培养基。第一组正常光照/黑暗交替培养(12h/12h)，第二组光照培养24h，第三组用牛皮纸包住三角瓶进行培养。培养基pH值为5.8，摇床转速120r/min，每组重复3～4瓶。

1.3.6 培养基pH值

导师对研究生的培养倾向于选择与其科研项目相关的知识、方法和目标，缺乏对研究生进行系统、全面的专业知识、科学方法、科研能力和学术道德的培养。有调查发现，52%的研究生认为“参与导师的科研项目对自己的科研能力提升程度”有“部分帮助”或者“很少帮助”;73%的研究生认为“导师课题和自己研究兴趣的一致程度”“部分一致”或“不一致”。［2］87

将新鲜、疏松连续继代3次以上的绿色愈伤组织2g接种到250mL三角瓶中培养，瓶内装50mL附加1.5mg/L6-BA和0.5mg/LNAA的MS液体培养基。培养基灭菌前pH值分别调到4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，摇床转速120r/min，每组重复3～4瓶。

1.3.7 生物量的测定

取悬浮细胞液置于离心管中，转速8000r/min，离心15min，弃去上清液，用蒸馏水洗涤细胞2～3次，弃去上清液，称得到沉淀细胞质量，即为细胞鲜重，置于烘箱中60℃干燥7～8h以至恒重，得到的质量为细胞干重。细胞干重增殖倍数=(收获的细胞干重-接种的细胞干重)/接种的细胞干重。

1.3.8 黄芩苷含量测定

1.3.8.1 样品溶液的制备

将黄芪细胞培养物50℃下烘干至恒重，用研钵将其研磨成细粉。用95%乙醇溶液对黄芩干细胞粉进行超声处理，每次20min，提取两次。混合两次提取液进行减压浓缩直至浸膏状，用95%乙醇溶解定容至50mL，备用。

1.3.8.2 黄芩苷含量测定

用紫外可见分光光度计在最大吸收波长278nm处测定制备好的溶液的吸光度A，根据标准曲线计算培养液中的黄芩苷含量，另取95%的分析乙醇溶液作空白。

1.3.8.3 标准工作曲线的绘制

精密称取0.0100g黄芩标准品，用乙醇制成100μg/mL的黄芩苷标准溶液。分别移取0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL于5个10mL的容量瓶中，用95%的分析乙醇溶液定容至刻度，充分摇匀，静置。选择空白乙醇溶液为参比，用紫外分光光度计测定其278nm处吸光度。选择吸光度A做纵坐标、黄芩苷含量C为横坐标得到标准工作曲线(图1)。标准曲线方程为A=0.5117C+0.0576，相关系数R2=0.9997。

图1 黄芩苷标准曲线Fig.1 Standard curve of baicalin

2 结果与分析

2.1 不同接种量对黄芩细胞悬浮培养的影响

接种量过小，细胞生长缓慢，培养时间延长；接种量过大，营养物质过量消耗，造成培养液溶氧不足，影响产物合成。接种量对黄芩细胞悬浮培养的影响结果见表1。随着接种量的增加，黄芩细胞的鲜重和干重也在增加，当接种量在2.5%时得到了黄芩细胞最大的干重增殖倍数，黄芩苷的合成也达到了最大值58.54μg/g。当接种量继续增加时，黄芩细胞的干重增殖倍数开始减小，黄芩苷的合成也急剧下降，表明细胞生长受到了抑制。综合分析，黄芩细胞悬浮培养的接种量也不是越多越好，选用2.5%的接种量最好。

表1 接种量对黄芩细胞悬浮培养的影响Table.1 Effects of different inoculum size on cell suspension culture of Scutellaria baicalensis

2.2 光照条件对黄芩细胞悬浮培养的影响

部分光照培养、光照24h和暗培养对黄芩细胞悬浮培养的影响见表2所示。实验结果表明：黑暗培养条件下，无论是黄芩细胞生长速率还是黄芩苷的合成速度均显著高于部分光照和光照培养条件，收获时黄芩苷含量达59.76μg/g，并且部分光照培养条件下的黄芩苷的含量高于黑暗培养条件。

表2 光照条件对黄芩细胞悬浮培养的影响Table.2 Effects of light conditions on cell suspension culture of Scutellaria baicalensis

2.3 培养液pH值对黄芩细胞悬浮培养的影响

培养液pH值对丹参黄芪细胞悬浮培养的影响见表3。当pH值较低时，黄芩细胞生长受阻，黄芩苷积累缓慢。当培养基pH值大于5.0时，黄芩细胞生长加速，pH值为6.5时，细胞生长速率达到最高。黄芩苷的合成量在pH值为6.0和pH值为6.5培养条件下比较高。综合分析，pH值为6.0的培养环境更适合黄芩细胞生长黄芩苷的积累。

表3 培养液pH对黄芩细胞悬浮培养的影响Table.3 Effects of pH on cell suspension culture of Scutellaria baicalensis

3 讨论和结论

影响植物细胞悬浮培养的因素很多，本实验选取了接种量、pH值、光照条件等三个因素对细胞生长的影响进行分析。在最适合的接种量下细胞可以迅速适应悬浮培养的条件开始正常繁殖。顾长海等[3]研究接种量对黄芩细胞生长的影响中得出接种量为1.0g/30mL条件下，最适合其生长，并且黄芩苷含量最高。其研究结果与本实验略有差别，可通过更加细化的接种量来做进一步实验进行验证。

培养基pH值可以影响细胞膜电荷的变化，影响细胞对营养物质的吸收和代谢途径中酶的活性。郭紫娟等[4]试验表明，白背三七悬浮细胞可以通过自身不断调节代谢活动改变培养环境的酸碱度，从而影响次生代谢产物的合成。姜鸿运等[5]在进行水飞蓟细胞悬浮培养时，发现当pH值小于6.0或高于7.5时，悬浮细胞严重褐化几乎不生长。pH值在6.0～7.0时，悬浮细胞增长量随着pH值的增加而增加；在pH值为7.0时，细胞增长量最大，达到8.68g，并且生长状态良好，颜色为淡黄色。

光是植物生长发育的重要物理因子，它可通过提供能量或触发光感受器，调控植物细胞生长发育、形态建成和次生代谢产物的合成[6]。钟春水等[7]试验结果表明黑暗是肌醇促进金花茶悬浮细胞生长的适宜条件。白木香悬浮细胞在黑暗培养下生长缓慢，在1500Lux的光照强度下，光照黑暗交替培养时，细胞的活力最高，细胞鲜重、生长密度分别较黑暗的提高了54.86%和52.94%，较24h光照的分别提高了33.09%和38.30%[8]。从本实验结果可以看到黑暗培养条件下进行，黄芩苷合成达到最大，与白木香的实验结果保持一致。

本文选取接种量、光照条件和pH值等3个因素进行分析，并以培养过程中细胞生长和黄芩苷含量变化为主要指标，探讨以上因素对于黄芩次生代谢的可能影响。由单因素实验结果分析可知，采用接种量2.5%，培养基初始pH值为6.0，黑暗条件下培养，最适于黄芩苷的积累，这为我们后续进一步开展黄芩悬浮细胞大规模培养提供了依据。