欧李果实发育期原花青素组分、含量及抗氧化分析

侯文赫，郭子微，郭彩珍，张建成，穆霄鹏，王鹏飞

（山西农业大学 园艺学院，山西 太谷 030801）

原花青素（proanthocyanidin，PA）又称缩合单宁，是植物中重要的多酚类化合物，在枝皮、叶片、根、果实及花朵中均有分布[1]。原花青素由类黄酮代谢途径合成，大部分的原花青素由CC和EC聚合而成，通常以低聚体（聚合度为2～4）和高聚体（聚合度≥5）的形式存在。原花青素生理功能具有多样性，除在植物防御机制中起作用，还可影响果实的品质及风味，可以使果实呈现涩味，其组分和含量直接影响果实风味[2]。前人在葡萄[3]、蔓越莓[4]、柿[5]等水果上已经开展了原花青素的积累合成及抗氧化能力的研究。原花青素具有特殊的分子结构，根据聚合程度不同分为单体、低聚体和高聚体。其中，低聚原花青素（OPC）抗氧化活性强于高分子原花青素（PPC）[6]。原花青素具有较高的医疗价值和保健功能。李书艺等[7]研究指出，原花青素可以有效抑制DNA损伤；刘丹丹等[8]研究发现，原花青素可有效调节糖尿病大鼠体内的铁代谢紊乱，减轻氧化损伤，对胰腺具有一定保护作用。因此，原花青素逐渐成为植物学、食品科学、医学等领域研究的热点[9-10]。

欧李（Cerasus humilis（Bge.）Sok.）属蔷薇科樱桃属矮生樱亚属植物[11]。作为第3代功能水果，除具有的营养价值、经济效益外，还具有极强的适应性、良好的生态价值和药用价值。果实中富含类黄酮、多酚、氨基酸、有机酸等营养和保健物质[12]。目前，关于欧李原花青素的研究较少，白东海[13]在研究欧李果实中的黄酮类物质的组分及含量时，发现原花青素的种类及含量丰富，因此，有必要深入研究欧李果实原花青素的积累机制和生物活性。

本研究采用高效液相色谱法测定了不同欧李品种果实发育期原花青素成分及其变化规律，分析了原花青素的抗氧化活性，可以作为改进欧李品质和开发的参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料 10个欧李品种（晋欧1号、10-32、02-16、7号、6号、5号、08-16、09-01、Y04-26、DS-1）均采自山西农业大学欧李种质资源圃，分别于幼果期、硬核期、转色期、成熟期采集果实样品。每个欧李品种10株为1个小区，重复3次，每个时期每株采集中上部5个果实。采后立刻装入冰盒，去柄、去核，液氮处理速冻，于-80 ℃超低温冰箱保存。

1.1.2 试剂 色谱级甲醇、乙醇、单宁酸、儿茶素（CC）、表儿茶素（EC）、原花青素B1（PCB1）、原花青素B2（PCB2）、原花青素A1（PCA1）、原花青素A2（PCA2）标准品均购自北京索莱宝生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱仪（Thermo公司）；C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）（Waters公司，中国上海）；紫外可见分光光度计（V-5200，上海元析仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 原花青素总量测定 采用盐酸-香草醛法[14]：称取欧李果实研磨样0.3 g，5 mL浸提液提取（40%盐酸-乙醇溶液，25 ℃超声提取1 h），然后以5 000 r/min 离心15 min，定容。取0.5 mL样品稀释液与3.0 mL 4%香草醛甲醇液和1.5 mL 37%盐酸充分混匀，30 ℃水浴20 min，500 nm处测吸光度，以蒸馏水为对照。儿茶素制作标准曲线，结果以每100 g鲜样含有的儿茶素毫克数表示。

1.3.2 单宁含量测定 采用Folin-Ciocalteau法[15]并稍作修改：准确称取0.25 g的研磨样，加提取溶剂浸提（乙醇浓度30%、提取温度60 ℃、提取时间4 h，固液比1∶30），120 00 r/min，离心15 min，取上清液，摇匀定容。将1 mL样品稀释液，与0.5 mL FD试剂（磷钼钨酸试剂）和7.5 mL蒸馏水混匀静置3 min，之后加入1 mL饱和碳酸钠混匀，反应1 h。用单宁酸标准品制作标准曲线，760 nm处测定吸光值，结果以每克鲜样中含有的单宁酸百分含量表示。

1.3.3 原花青素组分及含量测定 参考覃国新等[16]的方法，准确称取1.0 g欧李果实研磨样于10 mL离心管中，加入0.5 mL 85%乙醇水溶液，30 ℃超声提取30 min，在4 ℃、5 000 r/min条件下离心5 min，上清液转移至蒸发皿中，重复提取2次，合并上清液，蒸至近干，色谱级甲醇溶解并定容。将提取液用0.22 μm微孔滤膜过滤到1.0 mL进样瓶中，利用HPCL测定原花青素组分，每个样品重复3次。检测波长280 nm，进样量10 μL，柱温35 ℃。标准曲线绘制：分别精密称取CC、EC、PCB1、PCB2、PCA1、PCA2对照品，用色谱级甲醇定容，配制成1 mg/mL的对照品储备液，绘制标准曲线。样品中的原花青素成分含量以mg/100 g表示。

1.3.4 抗氧化能力测定[17]精密称取0.6 g研磨样，加入6 mL 40%甲醇水溶液于10 mL 离心管中，超声提取30 min ，12 000 r/min，离心10 min，回收上清，重复2次，定容[17]。

1.3.4.1 DPPH·清 除 法（DPPH法）[18]吸 取0.1 mmol/L DPPH溶液2.8 mL加入到0.2 mL上述待测液中，避光30 min，在517 nm波长处测定样品的吸光度，以提取液替代待测液与DPPH溶液反应后作对照。

1.3.4.2 ABTS+清除法（ABTS法）[19]反应液由7 mmol/L ABTS与140 mmol/L过硫酸钾溶液混合而成，避光后用乙醇稀释至吸光值为0.7左右；吸取3.9 mL反应液加入到0.1 mL上述的待测液中，混匀后避光10 min，于734 nm处测吸光值。

1.3.4.3 铁离子还原/抗氧化能力法（FRAP法）[20]取0.1 mol/L乙酸钠 缓 冲 液、20 mmol/L三氯化铁溶液和10 mmol/L三吡啶基三嗪（TPTZ）溶液，按10∶1∶1混合成为反应液；吸取4.9 mL反应液，加入到0.1 mL上述的待测液中，混匀后室温避光10 min，然后在593 nm处比色，重复3次。结果均以Trolox的当量表示。

1.4 数据处理

采用SAS 9.4统计软件进行显著性、相关性分析，采用Origin 2018、TBtools作图。

2 结果与分析

2.1 欧李果实发育期原花青素及单宁含量变化

10个欧李品种果实发育期原花青素含量的动态变化如图1所示。

图1 10个欧李品种果实发育期原花青素含量的动态变化Fig.1 Dynamic changes of proanthocyanidin content of 10 Cerasus humilis varieties during fruit development period

从图1可以看出，10个欧李品种中原花青素含量存在差异，并且随着果实发育进程推进原花青素含量逐渐减少，幼果期原花青素含量最高，成熟期最低；且在硬核期到转色期这一阶段果实中原花青素含量下降趋势显著（P＜0.05）。晋欧1号原花青素含量在整个果实发育期高于其他品种，幼果期为585.819 mg/100 g，成熟期含量降至89.448 mg/100 g。DS-1原花青素含量在整个果实发育期均低于其他品种，幼果期为394.305 mg/100 g，成熟期为35.761 mg/100 g。

由图2可知，10个欧李品种的单宁含量有差异，随着果实成熟逐渐降低。在幼果期，晋欧1号单宁含量最高，为3.07%；DS-1单宁含量最低，为2.09%；成熟时晋欧1号单宁含量为0.50%，DS-1单宁含量为0.43%。

图2 10个欧李品种果实发育期单宁含量的动态变化Fig.2 Dynamic changes of tannin content of 10 Cerasus humilis varieties during fruit development period

2.2 欧李果实发育期原花青素成分及含量的变化

由图3可知，在晋欧1号和DS-1果实中均检测到PCB1、PCB2、PCA1和PCA2及CC、EC，除PCB2外，其他组分含量均伴随果实成熟而下降。在晋欧1号果实中，PCA1和PCB2含量在整个发育期基本保持稳定，CC含量最高，为415.674 mg/100 g，PCB1含 量 次 之，为368.259 mg/100 g，最 少 的是PCA1，为6.673 mg/100 g。在DS-1果实中，PCB2含量在整个发育期基本保持稳定，CC含量最高，为250.171 mg/100 g，PCB1含量（151.734 mg/100 g）次之，最少的是PCA2，为1.547 mg/100 g。晋欧1号果实中CC和EC含量分别在成熟期和转色期低于DS-1，其余时期6种原花青素物质含量均高于DS-1。晋欧1号幼果期CC和PCB1的含量显著高于DS-1，分 别 是DS-1的2.43倍、1.66倍；而DS-1中PCA1的含量显著高于晋欧1号，幼果期PCA1含量是晋欧1号的3.6倍，成熟期PCA1含量是晋欧1号的2.1倍。表明不同品种原花青素积累能力存在较大差异，可进一步研究其积累差异的生理机制。

图3 欧李果实原花青素成分与含量变化Fig.3 Changes in components and content of proanthocyanidins in Cerasus humilis fruits

2.3 欧李果实发育期抗氧化能力的变化

由图4可知，DPPH自由基清除能力伴随果实发育逐渐变弱。晋欧1号的DPPH自由基清除能力呈现先升高后降低的趋势，在硬核期达到最高，为30.225 mg/g，成熟期最低，为8.241 mg/g；在DS-1中，DPPH自由基清除能力在果实发育过程中也表现出逐渐降低的趋势，在幼果期最高，为31.055 mg/g，成熟期最低，为5.883 mg/g。幼果期和转色期晋欧1号的DPPH自由基清除能力显著高于DS-1（P＜0.05），硬核期和成熟期DS-1 DPPH·自由基清除能力显著高于晋欧1号（P＜0.05）。说明不同品种间的DPPH自由基清除能力存在明显差异。

图4 欧李品种果实发育期3种抗氧化能力的动态变化Fig.4 Dynamic changes of three antioxidant activities in Cerasus humilis during fruit development period

由图4可知，欧李果实ABTS+清除力在不同品种间的变化存在差异，在晋欧1号中，ABTS+清除能力在果实发育早期缓慢上升，硬核期达到最高，为130.152 mg/g；随后开始下降，成熟期降为最低，为10.653 mg/g；而DS-1果实ABTS+清除力在果实发育过程中呈下降趋势，幼果期最高，为133.641 mg/g；成熟期最低，为6.299 mg/g。晋欧1号和DS-1的ABTS+清除能力在硬核期存在显著差异（P＜0.05），其他时期差异不显著。

由图4可知，欧李果实铁离子还原能力在不同品种中的变化存在差异，在晋欧1号果实生长过程中呈现先升高再降低的变化趋势，硬核期铁离子还原能力达到最高，为62.055 mg/g，成熟期最低，为18.738 mg/g；而DS-1果实铁离子还原能力在果实发育过程中呈下降趋势，幼果期最高，为37.33 mg/g；成熟期最低，为8.204 mg/g。果实发育的整个阶段晋欧1号的果实铁离子还原能力显著高于DS-1（P＜0.05）。

总体上，晋欧1号的ABTS、FRAP、DPPH自由基3种抗氧化活性均高于DS-1。2个品种的3种自由基清除能力随果实发育整体呈下降趋势。晋欧1号果实抗氧化能力在硬核期较高；而DS-1抗氧化活性在幼果期最高。

2.4 原花青素成分与抗氧化能力间的相关性分析

从图5可以看出，晋欧1号果实中3种自由基清除能力与总原花青素和PCB1均呈显著正相关（P＜0.05），与CC、EC均呈极显著正相关（P＜0.01）；PCB2与DPPH自由基清除能力呈显著相关（P＜0.05），与另外2种抗氧化能力有相关性但不显著，而PCA1和PCA2与3种自由基清除能力有相关性，但均不显著。

图5 晋欧1号原花青素与抗氧化能力的相关性Fig.5 Correlation between proanthocyanidins and antioxidant capacity in Jin'ou 1

由图6可知，DS-1果实中3种自由基清除能力与总原花青素和PCB1均呈显著正相关（P＜0.05），与CC和EC呈极显著正相关（P＜0.01），3种自由基清除能力与PCA2有较强相关性，但不显著；与PCB2和PCA1也表现出较高的相关性，但不显著。

图6 DS-1原花青素与抗氧化能力的相关性Fig.6 Correlation between proanthocyanidins and antioxidant capacity in DS-1

3 结论与讨论

在果实发育过程中，10个欧李品种果实的总原花青素和单宁含量下降，成熟时晋欧1号原花青素含量最高，DS-1含量最低。不同水果和不同品种果实中原花青素组分及含量会直接影响其风味和品质。ZHENG等[21]检测了不同柿品种原花青素含量的变化，随着果实成熟原花青素含量呈下降趋势，磨盘柿含量最高，其次为罗田甜柿。严娟等[22]对3种肉色桃的原花青素含量和积累趋势研究发现，不同肉色桃的原花青素含量存在差异，红肉桃原花青素含量最高，白肉桃次之，黄肉桃最低；且随着果实发育原花青素含量呈下降趋势。本试验对10个欧李品种果实的原花青素研究发现，果实发育过程中原花青素含量呈下降趋势，原花青素含量因品种而异。晋欧1号原花青素的含量最高，DS-1最低；10个欧李品种果实的单宁含量也随着果实的成熟逐渐降低，晋欧1号单宁含量也最高，DS-1单宁含量比较低，由此可知，在欧李果实中原花青素及单宁含量在果实发育过程中均呈下降趋势，且不同品种间原花青素和单宁含量存在差异，除此之外，10个欧李品种果实的原花青素和单宁含量均在硬核期到转色期含量显著下降。本研究表明，原花青素可影响果实涩度，推测不同欧李品种原花青素含量的差异可能是导致果实涩度差异的原因。

晋欧1号和DS-1果实中原花青素主要单体物质为儿茶素和表儿茶素，主要的聚合物为PCB1、PCB2、PCA1和PCA2，其中，儿茶 素和原 花青素B1含量最高，品种间差异显著。原花青素大部分由儿茶素和表儿茶素单体聚合而成，通常以聚合状态的形式积累，根据聚合程度的不同，一般将聚合度为2～4的称为低聚体，聚合度≥5的称为高聚体。目前聚合度高的原花青素分离、纯化的方法尚在研究中，还未能工业化生产[23]。山楂中分离所得的原花青素主要成分为儿茶素、表儿茶素及原花青素二聚体[24]；苏叶萍等[25]分离出了葡萄籽中的3种原花青素单体、9种二聚体和5种四聚体；板栗中鉴定出原花青素种类有儿茶素、表儿茶素、B型原花青素二聚体[26]。本研究检测了欧李果实中几种原花青素单体和二聚体，发现原花青素B1和儿茶素在果实原花青素组分中占有较高的比例。由此推测，大部分果实中原花青素主要单体物质为儿茶素和表儿茶素，化合物种类较多，且二聚体含量较高于其他多聚体，且结构相对稳定，由于原花青素二聚体结构稳定，因此，推测原花青素二聚体可能影响欧李果实涩度等方面，还需进一步研究。

目前，可用于抗氧化活性的检测方法有很多，由于抗氧化反应的多样性和复杂性，当检测具体某一样品的抗氧化活性时，由于样品在不同检测方法中可能作为抗氧化剂或促氧化剂[27]。因此，本研究中选择了3种体外抗氧化活性检测方法，其中ABTS、DPPH通过检测自由基清除能力反映样品的抗氧化活性，铁离子还原能力（FRAP）通过检测样品的还原能力来体现样品的抗氧化活性。FRAP、DPPH·法是评价天然抗氧化剂抗氧化活性的一种快速、简便、灵敏的方法，而ABTS也具有简便、灵敏和快捷的优点[28]。抗氧化能力是原花青素最重要的性质[29]，LIU等[30]对葡萄籽的研究发现，原花青素具有检测自由基的能力，原花青素的抗氧化活性与聚合度密切相关。而OPC拥有很强的抗氧化活性，尤其是二聚体抗氧化活性最强，目前在医学上有很多重要作用[31]。LING等[32]、KIM等[33]研究也发现，原花青素低聚体具有良好的生物活性，具有清除自由基（如DPPH、·OH和O2-·等）和抑制脂肪氧化酶活性的能力；徐潇吟等[34]研究发现，欧李果实原花青素通过提高抗氧化物酶活性，起到抑制氧化的作用。本研究表明，欧李果实中原花青素含量丰富，且原花青素二聚体含量占有较高比例，故欧李果实抗氧化能力较强，2个品种抗氧化能力随着果实成熟而降低，抗氧化能力与原花青素B1呈显著正相关，与儿茶素、表儿茶素呈现极显著正相关。原花青素在天然抗氧化剂和功能食品领域具有很大的开发应用价值。