CRISPR/Cas系统在生物核酸检测中的应用进展

王 倩，赵俊桃，陈 聪，曹英秀

(1.天祥(天津)质量技术服务有限公司，天津 300384；2.天津大学 化工学院 教育部系统生物工程重点实验室，天津 300350)

成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins，CRISPR/Cas)是古细菌和大多数细菌在生物进化过程中抵御病毒入侵而形成的一种适应性免疫防御系统[1]。早在1987年，Ishino等[2]在大肠杆菌中首次发现CRISPR序列，但并未引起广泛的关注。直到2012年，Doudna J A和Charpentier E等指导的学生Jinek等[3]首次证明CRISPR/Cas9可以在体外识别并切割靶标DNA，随后张锋团队的Cong等[4]和Church G M团队的Mali等[5]成功地将该系统应用于真核细胞。从此，基于CRISPR/Cas基因组编辑技术受到了科学界的高度重视，并取得了巨大进展。2020年诺贝尔化学奖授予Charpentier E和Doudna J A，以表彰她们在基因组编辑开发方面做出的巨大贡献。大量CRISPR/Cas新系统和新技术的发现与开发[6-11]，促进了基因编辑[12-16]、药理研究[17]、遗传筛选[18-19]、疾病建模与治疗[17,20]及分子诊断[21]等学科的快速发展。此外，科研人员发现部分Cas蛋白(如Cas12、Cas13和Cas14)具有“附带切割”活性，即Cas核酸酶可以裂解荧光报告分子，而被应用于生物传感中，并开发为有效、快速、低成本和高灵敏度的分子检测工具，推动了核酸检测技术的快速发展，并取得一系列重要成果。本文主要介绍CRISPR/Cas系统的分类及特征，综述了基于CRISPR/Cas系统的核酸检测领域的最新进展，并展望了CRISPR/Cas系统在生物检测领域所面临的挑战。

1 CRISPR/Cas系统简介

CRISPR/Cas系统是由Cas效应蛋白和CRISPR RNAs(crRNAs)组合而成的免疫防御系统，该系统主要通过适应、crRNA成熟和干扰这3个阶段实现免疫功能[11,22](图1)。在适应阶段，当外源的噬菌体、病毒或质粒DNA序列首次入侵时，Cas1-Cas2蛋白复合物识别外源DNA序列的前间隔区序列邻近基序(PAM)，并截取一段非重复序列将其作为新的间隔序列整合到宿主基因组的CRISPR序列中[22]。在crRNA成熟阶段，当外源的噬菌体、病毒或质粒DNA序列再次入侵时，CRISPR序列在RNA聚合酶的作用下转录成一条单一的前体CRISPR RNA(pre-crRNA)，之后被RNA内切酶切割成成熟的crRNA[23]。在干扰阶段，成熟的crRNA与具有核酸内切酶活性的Cas蛋白结合形成复合体，crRNA与特定序列互补配对，并引导Cas蛋白识别PAM位点并完成切割[24]。

图1 CRISPR/Cas系统的工作原理[22]Fig.1 Schematic diagram of the CRISPR/Cas system[22]

不同CRISPR/Cas系统的效应器模块存在很大差异[11]。在最新的分类中，根据Cas蛋白编码基因及干扰复合物的特性，CRISPR/Cas系统分为两类，并进一步分为6种、33亚型[22,25](图2)。在1类系统(Ⅳ型、Ⅲ型和Ⅰ型)中，干扰阶段由多个Cas效应蛋白复合物执行；2类系统包括Ⅵ型、Ⅴ型和Ⅱ型，使用单个效应器进行干扰[22]。由于单个Cas效应蛋白更有利于开发新的工具，所以目前常选择2类CRISPR/Cas系统进行应用工具的开发及改造。

图2 Cas相关蛋白的分类[25]Fig.2 Classification of Cas related proteins[25]

最常用的核酸检测工具箱为Cas9、Cas12、Cas13和Cas14，均属于第2类CRISPR/Cas系统[26](表1)。CRISPR/Cas9属于Ⅱ型CRISPR系统，是目前最常用的CRISPR/Cas系统[3-4,27]。典型的化脓链球菌的Cas9主要包括3个功能元件：crRNA、反式作用CRISPR RNA(tracrRNA)和Cas9核酸酶蛋白。crRNA与靶标双链DNA(dsDNA)序列同源，并与tracrRNA部分互补构成蛋白复合体，引导Cas9蛋白识别PAM位点并在特定位点切割[24]。为了简化基因编辑的过程，crRNA和tracrRNA通常被整合成单个向导RNA(sgRNA)用于识别靶标双链(dsDNA)[3]。Cas9蛋白由α-螺旋识别区(REC)、羧基端的PAM结合区和两个活性区域组成，包括HNH活性区域和RuvC活性区域。HNH结构域诱导靶链(sgRNA互补链)裂解，RuvC活性区域诱导非靶链裂解，产生平末端双链断裂(DSB)[28-30]。DSBs的产生会刺激细胞内的DNA修复机制启动。细胞中存在2种不同的酶辅助DNA修复途径，包括易错非同源端连接(NHEJ)和无错同源修复(HDR)途径[31-32]。NHEJ途径通常会引入缺失或插入突变，通过在开放阅读框中诱导移码突变，可以破坏靶基因的遗传功能；而HDR途径可以实现精确的基因编辑，在供体DNA模板存在的情况下，在体内外实现精确的基因编辑[33]。

表1 用于核酸检测的Cas效应蛋白的主要特征

最近发现的新型Cas蛋白(Cas12、Cas13和Cas14)具有不同于Cas9的新特性。在Cas12和Cas13中，重点介绍Cas12a和Cas13a。Cas12a也被称为Cpf1，属于Ⅴ型CRISPR系统[11]。Cas12a系统不需要tracrRNA，只需要与crRNA结合形成复合物就能识别PAM序列，在5′PAM下游切割dsDNA，产生黏性末端[34]。与Cas9产生的平末端相比，黏性末端可提高DNA修复时基因编辑的准确性。此外，与Cas9系统相比，Cas12a具有特异切割靶标单链DNA(ssDNA)的cis-和trans-切割活性，其中cis-切割不需要PAM序列辅助就可以特异切割靶标ssDNA。Cas12-crRNA与靶序列结合后，单链脱氧核糖核酸酶(DNase)活性被激活，能够非特异、无差别的任意切割体系中的ssDNA，这种特性就是trans-切割活性[35-36]，也被称为“附带切割活性”[36]。Cas13a，原名C2c2，属于Ⅵ型CRISPR系统，仅需要辅助单个crRNA就可以对靶标进行识别与裂解。与Cas9和Cas12a不同，Cas13a靶向切割单链RNA(ssRNA)，而不是DNA[6]。与Cas12a一样，Cas13a也具有附带切割活性。Cas13a的发现将基因编辑的范围从DNA拓宽到了RNA[37]。Cas14是一种仅在古菌中发现的Ⅴ型CRISPR系统，能够在无PAM序列的情况下识别并裂解ssDNA[9]，也具有附带切割活性。Cas14蛋白是目前为止发现的最小RNA引导效应蛋白，仅含有400～700个氨基酸(aa)，约为Cas9和Cas12a(950～1 400 aa)的一半[9]。

2 用于核酸检测的CRISPR/Cas系统

核酸是分子诊断技术检测感染性疾病、抗菌素耐药性基因、癌症或遗传疾病发展相关的突变(如杜氏肌营养不良症等)、单核苷酸多态性(SNPs)和生物标记物的重要目标[9]。CRISPR/Cas系统具有高效识别核酸的能力，已被证明是可用于核酸检测的高效工具。通过联合CRISPR/Cas系统与传统的聚合酶链式反应(PCR)技术或等温扩增技术，科学家们开发出多个基于CRISPR/Cas系统的核酸检测系统[38]。近年来，纳米技术、生物分子识别技术、界面修饰技术和分子组装技术等[39]核酸检测技术已经广泛应用到多个领域，如转基因(GMO)食品检测[40]、血液供应筛选[41-42]、疾病诊断[43-44]、基因表达谱分析[45-46]、基因座标记[47]、跟踪环境中的生物污染[48-49]和新型冠状病毒检测[50-51]等。

2.1 基于CRISPR/Cas9的核酸检测系统

可编程的Cas9核酸内切酶已被证明是核酸检测的强大生物识别元件[9]。通过将Cas9与不同的核酸扩增方法相结合，可以实现病毒分型和单核苷酸多态性(SNPs)的检测。最近开发的三代CRISPR型PCR(ctPCR)利用Cas9-sgRNA复合物识别并切割目标DNA，然后将切割后的DNA修饰成可以通过PCR或qPCR扩增的形式。在ctPCR1.0中，切割后的DNA末端带有腺嘌呤A，通过胸腺嘧啶T衔接子连接上一对引物并进行扩增[52]；而ctPCR2.0中，切割后的产物可以进行分子间串联，从而形成线性DNA或环状DNA[53]。由于连接过程的差异，2.0版的检测灵敏度得到了提高。二者都可以区分人类乳头瘤病毒(HPV病毒)的HPV16和HPV18，但它们都需要在Cas9切割之前先进行一轮PCR扩增，以保证检测的灵敏度。ctPCR3.0版利用一轮qPCR过程就实现了对靶DNA的检测，简化了检测流程[54]。

表2比较了几种基于CRISPR/Cas9系统开发的核酸检测相关生物传感系统。2016年，Pardee等[55]首次使用CRISPR/Cas9系统作为病毒诊断工具，结合了基于核酸序列的扩增反应(NASBA)和CRISPR/Cas9系统，并借助toetold开关开发出一种低成本且实现寨卡病毒(ZIKV)的检测和分型的纸基传感器，这种生物传感系统被命名为NASBACC(NASBA-CRISPR Cleavage)。该系统基于一种工程寡核苷酸传感器，采用NASBA扩增ZIKV的靶标后，将Cas9与寡核苷酸传感器结合进行靶标检测：在识别目标RNA时，触发β-半乳糖苷酶(LacZ酶)的翻译，将纸盘上的黄色底物(氯酚红-D-半乳糖苷)转化为紫色产物(氯酚红)，通过肉眼观察颜色变化即可实现ZIKV的检测。2018年，Zhou等[56]开发了一种称为CRISPR/Cas9触发的缺口内切酶介导的链位移扩增(CRISDA)的方法，可将Cas9的检测限提高到了10-18(阿摩尔级，amol)水平，用于人乳腺癌基因分型和转基因大豆的检测：首先，利用HNH催化残基突变的Cas9识别特异性靶标DNA并在非靶标DNA中切出一对独特的缺口，使引物对杂交到非靶标链上；其次，加入链置换扩增(SDA)混合物后，依次利用线性切口内切酶和指数切口内切酶进行扩增；最后，通过与肽核酸(PNA)入侵介导的终点测量结合实现定量检测。同年，Huang等[57]利用CRISPR/Cas9触发等温指数扩增反应(CAS-EXPAR)，开发了一种位点特异性NT试剂盒，该试剂盒不需要任何外部引物，而是将Cas9蛋白切割后的产物作为引物，利用Cas9的靶特异性刻痕内切酶介导EXPAR完成扩增，并采用实时荧光法检测反应。该策略结合了CRISPR/Cas9和指数扩增的优点，特异性高，扩增动力学快，为高效核酸扩增提供一个新的范例，并具有分子诊断应用的潜力。2020年，一种用于非洲猪瘟病毒(ASFV)诊断的新型便携式核酸检测系统被开发，称为Cas介导的横向流动分析(CASLFA)[58]，该诊断试剂盒采用基于CRISPR/Cas9的超灵敏侧流核酸诊断ASFV病毒。

表2 基于CRISPR/Cas9系统的便携式核酸检测系统

此外，失去切割活性的Cas9(dCas9)仍然可以在sgRNA的引导下特异性地结合到目的位点，这个特性也可以用于开发新的基于CRISPR/Cas的核酸生物传感系统[59]。2017年，Guk等[60]将CRISPR/dCas9系统纳入荧光原位杂交(FISH)技术流程，开发了一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法，称为DNA-FISH。在该体系中，靶序列被磁性纳米珠缀合的dCas9/sgRNA识别后，在磁场的作用下富集，进而与荧光染料SYBR Green Ⅰ反应产生荧光信号。该方法可检出低至10 CFU的MRSA，并能高特异性地区分MRSA与对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)。Azhar等[50]于2020年开发了基于CRISPR/dCas9系统的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)诊断试剂盒，该试剂盒被命名为FnCas9编辑器链接统一检测法(FELUDA)，通过使用荧光素酰胺(FaM)tracrRNA-sgRNA和抗FaM抗体与纳米颗粒结合，利用高度精确的酶识读来检测核苷酸序列，识别碱基身份，并精确推断合子性，适用于新型冠状病毒肺炎等传染病暴发期间的快速诊断。

2.2 基于CRISPR/Cas12的核酸检测系统

与CRISPR/Cas9系统相比，Casl2a可直接在crRNA的引导下与dsDNA结合并完成切割。表3比较了几种基于CRISPR/Cas12系统开发的核酸检测相关生物传感系统。2018年，Doudna等[36]利用Cas12a的附带切割活性开发了DNA内切核酸酶靶向CRISPR反式报告基因(DETECTR)的方法。该方法首先利用重组酶聚合酶扩增(RPA)样品，CRISPR/Cas12a与扩增产物混合后被靶标序列激活，切割靶序列和反应体系中的ssDNA荧光探针，释放荧光信号，从而对HPV病毒进行准确、快速检测。DETECTR已显示出从临床标本中检测病毒的巨大能力，仅需1 h即可完成病毒检测，且具有amol级的灵敏度。Broughton等[61]在2020年将DETECTR用于SARS-CoV-2的检测，他们使用逆转录-环介导等温扩增技术(RT-LAMP)扩增提取的严重急性呼吸综合征(SARS)-CoV-2 RNA，从而产生dsDNA产物，之后用Cas12对报告基因进行侧枝裂解检测dsDNA产物，然后用横向流动条产生读出信号。受DETECTR方法的启发，Teng等[62]于2019年开发了Cas12b介导的DNA检测方法(CDetection)，可以在单碱基水平上区分HPV病毒核酸序列的差异。基于Cas12b的反应温度与环介导等温扩增技术(LAMP)相同，Li等[63]开发了基于CRISPR/Cas系统的最简单RNA检测平台，称为“第二版一小时低成本多用途高效系统”(HOLMESv2)检测平台，在1 h内即可快速检测乙型脑炎病毒。这是因为HOLMESv2可以特异性鉴别SNPs，在恒温条件下结合LAMP扩增一步系统可以方便地定量目标核酸，通过结合Cas12b检测和亚硫酸氢盐的处理可以准确定量靶点DNA甲基化。

表3 基于CRISPR/Cas12系统的便携式核酸检测系统

除了核酸检测外，Cas12a还被开发为小分子检测的高通量平台。2019年，Liang等[64]开发了CRISPR/Cas12a和变构转录因子(aTF)介导的小分子探测器(CaT-SMelor)方法，成功地检测了人类血清样本中的尿酸。功能性的dsDNA包含1个可被纤维素结合域-变构转录因子(CBD-aTF)识别的序列，并因此被固定在微晶纤维素上，当目标分子出现并与aTF结合时，aTF的构象发生变化，从而释放dsDNA，触发Cas12的附带切割活性。因此，通过测定ssDNA荧光探针所产生的荧光信号的变化，就可以对目标小分子进行定性定量分析。Xiong等[65]开发出一种通用的功能DNA(fDNA)调节的CRISPR/Cas12a传感器，将CRISPR系统用于常温(25 ℃)环境下三磷酸腺苷(ATP)和Na+快速定量检测，仅需要15 min；在不存在非核酸靶标时，fDNA与靶标DNA结合，阻止其与Cas12a结合，而在非核酸靶标存在的情况下，靶标DNA被释放，激活Cas12a，从而导致荧光信号的增加。

2.3 基于CRISPR/Cas13的核酸检测系统

CRISPR/Cas13的附带切割活性、特异性靶向ssRNA的特性及SHERLOCK技术的发展促进了该系统在核酸检测方向的应用。与HOLMES类似，基于Cas13的检测系统需要对目标基因组、crRNA和荧光ssRNA探针进行等温扩增。此外，该技术还需要一个合成体外RNA的额外步骤，一旦crRNA与扩增RNA结合，Cas13对其进行切割，并开始对附近的ssRNA探针进行侧切，之后通过荧光技术进行测量和定量[21]。表4比较了几种基于CRISPR/Cas13系统开发的核酸检测相关生物传感系统。2017年，张锋团队的Caliendo等[66]和Gootenberg等[67]开发了基于CRISPR/Cas13a的特异性高敏酶报告基因解锁(SHERLOCK)检测平台技术：首先，利用RPA扩增或逆转录-RPA(RT-RPA)将样品扩增为含有T7启动子的DNA模板；随后，进行转录，RNA产物作为靶标被Cas13a识别并切割；最后，Cas13a的附带切割特性被激活，同时切割反应体系内的ssRNA荧光探针，使其发出荧光信号。该方法能够以单碱基特异性快速对DNA或RNA进行检测，已成功应用于检测ZIKV、登革热病毒、耐药菌、人类基因型和癌症突变等方面。2018年，该团队将SHERLOCK进一步改进为第二代SHERLOCK(SHERLOCKv2)，将Cas13a与一种辅助的CRISPR Ⅲ型核酸酶Csm6联用，实现了多通道检测与横向流读数并进一步提高了灵敏度[68]，能够在非常低浓度(低至1拷贝/微升)的生物液体中直接检测致病样品的核酸。目前，SHERLOCK技术已经应用于检测鼻咽喉拭子样本的SARS-CoV-2，实现了极限内100%敏感的荧光信号的监测[69]。与此同时，Myhrvold等[70]研制出了加热未提取的诊断样品以消除核酸酶(HUDSON)技术，利用加热和化学还原方法，可以同时裂解病毒颗粒并灭活体液中的高水平核糖核酸酶，通过将HUDSON和SHERLOCK结合起来，可以在不使用仪器的条件下，在2 h内从病人的样本中检测出登革热病毒，这具有在低技术水平的条件下检测病毒的潜力。

近期，针对SARS-CoV-2的诊断，Rauch等[51]还引入了一种基于CRISPR/Cas13系统的新方法，该方法是坚固的、合理的、可扩展的测试技术(CREST)，利用低成本的仪器进行检测，但不影响检测灵敏度。CREST利用广泛使用的酶、低成本的热循环仪和易于使用的荧光显像仪，解决了限制基于Cas13测试可扩展性的3个主要障碍:试剂可及性、设备可用性和成本。同时，CREST与COVID-19检测中最常用的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法的灵敏度相当。Shen等[71]开发了一种称为APC-Cas的检测方法，实现了沙门氏菌的定量检测，该体系利用特异性变构探针(AP)识别目标病原体：在病原体存在的情况下，AP能特异性与目标病原体结合，改变构象，并在引物和DNA聚合酶的作用下合成dsDNA；随后，利用T7 RNA聚合酶产生大量ssRNA，用于激活Cas13a的附带切割能力；最后，Cas13a裂解ssRNA探针，产生荧光信号。

2.4 基于CRISPR/Cas14的核酸检测系统

与Cas12和Cas13类似，Cas14a也具有非特异性附带切割活性。与Cas12a相比，Cas14a对ssDNA的特异性识别能力更强，且不受PAM序列的限制，所以Cas14a可应用于单碱基突变的核酸检测系统[38]。Harrington等[9]在DETECTR的基础上，对Cas14效应蛋白进行改进，使它能用于当前使用Cas12和Cas13快速检测传染性生物和基因突变存在的诊断系统，称为Cas14-DETECTR系统，该系统用于检测人类HERC2基因；同时发现，Cas14-DETECTR不受PAM序列的限制，可以对SNPs进行高保真检测，但由于其仅能靶向ssDNA，因此需将扩增后的dsDNA的一条链降解，在一定程度上增加了操作的复杂性。

3 CRISPR/Cas系统用于核酸检测的优势与挑战

CRISPR/Cas系统具有作为疾病和病原体检测诊断工具的潜力。大多数已报道的CRISPR/Cas生物传感系统具有易于开发/再开发、高分辨率、高灵敏度和低成本的优点。

3.1 生物核酸检测的通用性

虽然上述每一种检测方法都只涵盖一到两种应用领域，但有的系统成功地展示了其作为一种通用型生物感应策略在更为广泛的领域中使用的潜力。例如，Wang等[58]开发了CRISPR/Cas9介导的CASLFA，以识别单核增生李斯特菌和ASFV病毒。Dai等[72]设计了一种基于CRISPR/Cas12a的电化学生物传感器(E-CRISPR)，用于检测临床样本中的病毒核酸(HPV-16和PB-19)以及转化生长因子b1(TGF-b1)蛋白。由于gRNA序列易于被修改，因此基于CRISPR的诊断设备可以检测任何目标核酸序列，具有随时适应检测突发性病毒感染的潜力。在DETECTR基础上，Broughton等[61]开发了SARS-CoV-2 DETECTR，用于快速、准确地从患者样本中检测SARS-CoV-2。虽然已有多种基于CRISPR/Cas系统的核酸检测方法用于细菌、病毒和癌症突变等靶标的检测，但是使用这些方法的一个潜在风险是对基因组序列的脱靶效应不能完全避免，而且脱靶效应可能导致假阴性或假阳性的出现。我们推测，找到新的Cas效应蛋白或可替代的Cas变体以改变CRISPR系统的特异性，采用线上工具合理设计gRNA或对gRNA进行化学修饰可能促进脱靶效应的解决。未来，随着脱靶点的改进及脱靶效应的解决，CRISPR/Cas技术在分子检测中的准确性也将得到大幅度提高。

3.2 高分辨率和高灵敏度

以传统的PCR为基础的诊断方法具有较高的灵敏度和特异性，但需要特殊的仪器，操作人需要专业技能，限制了其广泛应用。与基于PCR的传统检测方法相比，在结合适当的扩增方法的条件下，大多数基于CRISPR的核酸诊断系统都显示出了单碱基分辨率和amol级灵敏度的核酸检测能力。例如，SHERLOCK技术采用的RPA扩增方法将检测灵敏度从皮摩尔(pmol)级提高到amol级[67]。在最近的研究中，Shi等[73]基于CRISPR/Cas12a系统精准序列识别特性及附带切割催化活性，构建出一种CRISPR/Cas12a自催化核酸正反馈网络(CONAN)，利用CRISPR/Cas12a驱动的人工核酸回路实现了临床样品中基因组核酸靶标的超灵敏和高特异性检测。与传统的基于CRISPR/Cas的核酸诊断系统相比，这种方法不需要结合其他核酸扩增技术，仅依赖CRISPR/Cas12a系统自身就可以实现超灵敏的核酸检测，使操作系统更加简便，为推进核酸回路应用于医疗分子诊断提供了一种切实可行的策略，也在推动早期诊断、疾病治疗、传染病防治等方面具有广阔的应用前景。未来的工作可以进一步开发出更加精简、灵敏度高的人工核酸回路用于特异性核酸分子诊断。

3.3 低成本

基于CRISPR/Cas的检测方法摆脱了复杂的仪器、昂贵的试剂和专业操作人员，因此在成本方面有了很大的优势。胶体金试纸条可以大批量生产，在室温下能储存一年以上，并可在日常生活中使用[55]。例如，SHERLOCK试纸条的检测费用约为0.61美元[65]，这十分适合于低成本的即时诊断。除了试纸条，借助生物传感器将检测信号转换为一系列易读信号，并借助裸眼或便携式仪器进行检测结果的输出，也可以大大降低成本。为了实现SARS-CoV-2的便携式及时检测，基于CRISPR/Cas12a系统的磁性下拉辅助比色法(M-CDC)和RT-RPA偶联CRISPR/Cas12a比色法都使用金纳米颗粒(Au NPs)探针作为信号输出，无需使用精密的光学仪器，通过肉眼即可实现检测[74-75]。基于CRISPR/Cas12a系统的CRISPR集群检测方法利用逆转录重组酶辅助扩增技术(RT-RAA)扩增样品后，结合CRISPR/Cas12a系统和葡萄糖将检测信号转化为葡萄糖信号，使用便携式的个人血糖仪在几秒内即可读取结果，大大降低了材料成本及检测时间[76]。与依赖特定仪器的RT-qPCR检测方法相比，已研究的新型核酸检测系统成本大大降低。为了进一步降低成本，这些新型核酸检测系统已经用来生产可用于现场的检测试剂盒，这些试剂盒不需要特定的仪器或昂贵的试剂，具有高效、低成本、简单易用的优点，非常适合低成本的医疗点诊断。相信通过进一步的系统优化，预计检测的价格会更低。

3.4 定量检测

对于待检物质的定量分析对于疾病诊断来说是十分必要的。目前已有多种方法可以实现对核酸的半定量或定量检测。Hajian等[77]开发了CRISPR-CHIP系统，用于快速识别和量化目标DNA序列，该系统结合了CRISPR/dCas9和石墨烯基场效应晶体管(gFET)的优点，gFET对其表面分子的静电相互作用十分敏感，目标DNA一旦与被dCas9 CRISPR复合物功能化的石墨烯识别，就可以在15 min内影响电信号的输出。随后，Bruch等[78]将Cas13a与电化学微流体生物传感器结合在了一起，结果发现：在靶标存在的情况下，生物素和6-羧基荧光素(FAM)双重标记的报告RNA将被裂解；如果体系中不存在靶标，葡萄糖氧化酶会被报告RNA固定在电极附近，催化葡萄糖产生H2O2，进而产生电流。目前，该系统已被用于定量检测潜在的肿瘤标志物microRNAs。2020年，徐志南课题组的Huang等[79]将RAA和CRISPR/Cas12a组成的目标识别系统与基于金纳米棒的级联反应诱导多色信号读出策略相结合，实现了转基因作物的半定量检测。同年，丁显廷课题组的Wang等[80]基于CRISPR/Cas12a的附带切割活性开发了一种高精度超灵敏的单锅工具箱(OCTOPUS)，该方法将基因组DNA提取、RPA扩增和Cas12a切割在同一离心管完成，只需在RPA扩增后，通过离心将原本附于离心管盖上的Cas12a立即添加到反应体系，即可快速完成amol级的定量核酸检测。2021年，一种基于CRISPR/Cas13a系统trans-切割活性的视觉检测系统(vCas)也被用于定量检测潜在的肿瘤标志物microRNAs[81]，这种方法通过DNA聚合酶介导的滚环扩增(RCA)扩增靶标microRNAs，之后将RCA产物与氯化血红素和2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐混合显色，用肉眼即可定量观测目标microRNAs。

3.5 多通路检测

SHERLOCKv2是第一个具有多重检测能力的系统，但是，目前这种方法仅限于同时检测4种靶标，限制了其实际应用。最近，Ackerman等[82]开发了一个可扩展的多路核酸检测平台，称为用于核酸多重评估的组合排列反应(CARMEN)：向每种待测样品和检测物中加入一种独特的荧光染料，并将其分成小液滴，芯片上的每一个微孔都能捕获一滴样品溶液和一滴检测物溶液，当核酸序列被识别时，就会产生荧光信号，CARMEN和Cas13检测的结合能够在单个芯片上进行超过4 500次测试。可见，CRISPR/Cas系统的多通路靶向潜力使研究人员能够对细胞代谢过程的复杂的操纵。

3.6 新型Cas蛋白的发现与工程化改造

Cas9和Cas12能够在任何需要的位置识别和切割，但它们大多数都需要PAM序列的辅助[83]，只有部分Cas12a效应蛋白进行附带切割时不严格依赖于PAM序列[84-85]。这就部分限制了其在进行较短序列检测方面的应用[86]。此外，CRISPR/Cas检测系统的检测时间仍较长。第一，Cas蛋白检测灵敏度较低，因此需要结合适当的扩增方法。但是，即使是最快速的LAMP和RPA扩增方法也需要15～60 min[87]；第二，Cas蛋白的反应速度较慢。Cas12-DETECTR的检测时间为1 h[36]，Cas13-SHERLOCK则需要0.5～3 h[67]。为了提高反应速度，科学家们正在寻找新的Cas蛋白，并通过添加新的成分来优化反应。因此，新Cas蛋白的开发及对现有的Cas蛋白进行合理的工程化改造，对于开发新一代检测方法至关重要。

4 总结与展望

CRISPR/Cas免疫系统的发现和Cas内切酶的表征正在掀起一场基因编辑和分子诊断的革命。传统的核酸检测技术耗时长且对操作人员的专业水平要求高，因此开发精准、快速、便携、低成本、高特异性和灵敏度的新核酸检测系统具有重要意义。目前的系统在检测核酸、小分子和细菌病原体方面已经成功地展示了高灵敏度、超分辨率特异性、低成本和高效率的潜力。然而，现有的检测系统大多不能实现定量、多通道检测，PAM序列的依赖性和检测时间的延长也限制了其应用。随着CRISPR/Cas技术的快速发展，这一检测系统将在疾病诊断、环境评估、食品质量快速评估等其他领域有巨大的应用前景。

目前应用于核酸检测的CRISPR/Cas系统主要涉及Cas9、Cas12、Cas13和Cas14。随着各种Cas效应蛋白的出现，多种核酸检测方法(SHERLOCK、HOLMES、DETECTR和HUDSON等)得到了迅速发展，而这些代号只是这种新型生物传感技术在诊断领域的开端。虽然现有的核酸检测方法已经向我们展示了它们在诊断领域的强大作用，但是在应用于临床诊断之前，科学家们依旧需要做大量研究以保证核酸诊断过程的准确性。除此之外，现有的CRISPR/Cas系统虽然有助于核酸检测方法的开发与改进，但是其进一步开发及常规应用仍面临着很多挑战，如大多数基于CRISPR/Cas12与CRISPR/Cas9系统的核酸检测技术对检测设备及靶标核酸富集的依赖性强。因此，为了开发出更加完善的核酸检测方法，挖掘新的Cas蛋白并对其进行工程化改造、新扩增方法的建立、结合高效的技术平台都是值得关注和期待的。CRISPR/Cas生物传感技术的巨大潜力正在不断激发人们开发下一代核酸检测平台的研究及应用。我们相信，在不久的将来，新Cas效应蛋白的发现将会进一步解开生物认知元素的多面谜题。