闽楠种子对快速脱水的响应

李 娟，林建勇，欧汉彪，梁瑞龙

（广西壮族自治区林业科学研究院 中南速生材繁育国家林业和草原局重点实验室 广西优良用材林资源培育重点实验室，广西南宁530002）

闽楠（Phoebe bournei）为樟科（Lauraceae）楠属高大常绿乔木，为国家二级野生保护植物，也是我国特有的珍贵树种；天然分布于浙江、福建、江西、广东、广西、湖南、湖北和贵州等地，垂直分布海拔范围为100～1 000 m，均为聚集状零星分布[1-2]。闽楠素以材质优良闻名于国内外，但由于长期对该树种资源的不合理开发利用，其天然资源已近枯竭。闽楠结实有明显的大小年现象，种子具有休眠特性，采收后不能直接萌发，也不耐储藏，给闽楠苗木繁育和造林带来诸多不便。种子是育苗造林的物质基础。影响种子寿命的重要因素是种子含水量和贮藏温度[3]。脱水是种子在贮藏或环境胁迫中存活、保证物种更好繁衍的适应性策略。Roberts根据低温、脱水反映及储藏行为，将种子分为正常性和顽拗性两类[4]，还发现介于正常性和顽拗性之间存在第3种类型,即中间型[5]。不同类型的种子脱水敏感性不同，直接影响种子储藏和种质资源的保存[6-11]。

吴大荣等[12]、周佑勋等[13]、李铁华等[14]和李娟等[15]分别从种子生态学、休眠和萌发特性、种子活力及形态特征等方面对闽楠种子进行研究，但对闽楠种子的脱水耐性鲜有研究。本研究以闽楠种子为试验材料，分析脱水对闽楠种子活力和萌发率的影响，确定闽楠种子脱水耐性及适宜贮藏的含水量，并从代谢作用、抗氧化酶系统的角度探讨闽楠种子脱水敏感性机制，为解决闽楠种子的贮藏问题，保证生产用种安全及长期保存闽楠种质资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

闽楠种子采自重庆江津。2018年12月14日，采收闽楠成熟果实，将果皮去除后得到新鲜种子，立即进行试验。

1.2 试验方法

1.2.1 种子脱水处理

将新鲜种子装入尼龙网袋，按照20∶1的体积比放入装有变色硅胶的密闭干燥器中，硅胶变红即更换。在第0、12、24、48、72、96、120、144和168 h分别取样。每次取样时，将用于测定酶活性和电导率等指标的种子样品放入液氮速冻，置于-80℃冰箱内保存。

1.2.2 种子含水量测定

烘干前，采用电子天平（精确至0.001 g）将每个处理的种子称重1次；随后置于已烘干且称过重的铝盒中，于105℃烘至恒重，称量种子重量。每处理10粒种子，3次重复。含水量（%）计算公式为[16]：

1.2.3 种子生活力测定

将闽楠种子剥去外种皮，采用0.4%的2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液浸泡，在25℃水浴锅中水浴8～12 h，倒出TTC溶液，用蒸馏水冲洗种子3次，观察着色情况。整个胚被染成红色，表示有活力；胚仅有一小部分被染成红色或完全呈白色，表示无活力。以新鲜种子为对照（CK），每处理20粒种子，3次重复。

1.2.4 种子萌发试验

在种子解除休眠后，在直径9 cm的培养皿内铺垫0.5 cm厚的河沙（125℃高温灭菌12 h），将种子均匀平铺于其上，放入自动光照培养箱，培养条件为25℃，14 h光照/10 h黑暗。胚根突破种皮5 mm记为发芽，每日观察、记录萌发情况，连续3天没有新种子萌发，结束试验。试验过程中适时浇水，保持沙子湿润。每处理20粒种子，3次重复。

1.2.5 相对电导率测定

不同处理的种子各取10粒，称重后，用清水冲洗3次，再用去离子水冲洗两次，放入烧杯，加入30 mL蒸馏水浸没种子，在25℃条件下浸种23 h，用电导率仪测定电导率（S1）；之后用塑料薄膜封瓶口放入沸水浴中15 min，取出后冷却至25℃，测定其电导率（S2），以不加种子的去离子水作为空白对照，设3次重复。相对电导率（L，%）计算公式为[17]：

1.2.6 种子抗氧化酶活性测定

采用氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性，采用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶（CAT）活性[17]。

1.3 数据处理

采用Excel 2010软件处理数据和制作图表，采用SPSS 18.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 种子含水量和生活力变化

新鲜闽楠种子的含水量为35.53%，种子失水速率呈现“快-慢-快”的趋势（图1）。0～24 h，含水量从35.53%降至32.17%；24～48 h，失水速率变慢；48～120 h，失水速率逐渐加快；120～144 h，失水速率最快。

图1 闽楠种子含水量Fig.1 Moisture content of P.bournei seeds

不同含水量种子生活力和发芽率差异显著（P＜0.05）（图2）。随含水量下降，种子发芽率呈先升后降的趋势；含水量为33.72%（T2）时，种子发芽率最高（40.00%），与CK（T1）差异显著（P＜0.05）。随含水量下降，种子生活力呈先升后降的趋势；含水量低于31.22%（T4）时，种子生活力与CK差异显著（P＜0.05）。含水量降至16.09%（T9）时，种子完全失活。

图2 闽楠种子生活力、发芽率和含水量的关系Fig.2 Relationships among seed viability,germination rate and moisture content of P.bournei

2.2 种子电导率变化

在闽楠种子脱水过程中，电导率呈现不规则波动变化（图3）。不同含水量种子的电导率差异显著（P＜0.05）。含水量从35.53%（T1）降至31.22%（T4）时，电导率最大（52.46%）；含水量从31.22%（T4）降至29.12%（T5）时，电导率急剧下降，此后又逐渐上升。

图3 脱水对种子电导率的影响Fig.3 Effect of dehydration on seed conductivity

2.3 种子SOD活性变化

在脱水前期，种子SOD活性呈波动变化（图4）。不同含水量种子SOD活性差异极显著（P＜0.01）。含水量为33.72%（T2）和31.22%（T4）时，SOD活性极显著高于其他含水量（P＜0.01）；含水量低于31.22%（T4）时，随含水量下降，SOD活性呈下降趋势。

图4 脱水对SOD活性的影响Fig.4 Effect of dehydration on SOD activity

2.4 种子POD活性变化

POD活性在闽楠种子脱水过程中整体呈上升趋势（图5）。不同含水量种子POD活性差异极显著（P＜0.01）。含水量从35.53%（T1）降至32.17%（T3），POD活性急剧增加，之后变化较平缓，其活性一直保持在较高水平。

图5 脱水对POD活性的影响Fig.5 Effect of dehydration on POD activity

2.5 CAT活性变化

CAT活性在闽楠种子脱水过程中呈波动变化（图6）。不同含水量种子CAT活性差异极显著（P＜0.01）。含水量为33.72%（T2）时，CAT活性最大（145.86 nmol·min-1·g-1），极显著高于CK（P＜0.01）；此后，CAT活性下降，到脱水中后期有较大幅度上升；含水量为19.64%（T8）时，CAT活性达到第2个峰值（179.01 nmol·min-1·g-1）；含水量降至16.09%（T9）时，CAT活性降至最低（39.02 nmol·min-1·g-1），此时种子完全失活。

图6 脱水对CAT活性的影响Fig.6 Effect of dehydration on CAT activity

2.6 MDA含量变化

不同含水量种子MDA含量差异显著（P＜0.05）（图7）。含水量从35.53%（T1）降至31.22%（T4）时，MDA含量呈“降-升-降”的趋势；含水量低于31.22%（T4）时，随含水量下降，MDA含量不断上升；含水量为16.09%（T9）时，MDA含量高于其他处理。

图7 脱水对MDA含量的影响Fig.7 Effect of dehydration on MDA content

2.7 相关性分析

种子含水量与其他生理指标具有一定的相关性（表1）。种子含水量与生活力、发芽率均呈极显著正相关（P＜0.01），表明含水量下降对种子萌发产生极大影响。SOD活性与种子生活力、发芽率均呈显著正相关（P＜0.05）；POD活性与种子含水量、生活力均呈极显著负相关（P＜0.01），与发芽率呈显著负相关（P＜0.05）。

表1 闽楠种子脱水过程中各指标的相关性Tab.1 Correlations among different indexes during seed dehydration of P.bournei

3 讨论与结论

3.1 讨论

顽拗性种子成熟时含水量高，对脱水敏感，不耐低温，难实现长期保存[18]。本试验结果显示，闽楠种子初始含水量为35.53%，种子生活力为55.00%；含水量降至29.12%时，其生活力和发芽率均降至13.33%，显著低于初始状态；含水量降至16.09%时，种子完全失活，种子变黑变硬。相关分析结果表明，闽楠种子含水量与种子生活力、发芽率均呈极显著正相关，这表明其具有明显的顽拗性特征，也证明含水量是影响闽楠种子活力的重要因素之一，是闽楠种子保存的关键制约因素。

研究表明，轻度脱水可促进种子发芽，提高种子萌发率。樟树（Cinnamomum camphora）[19]、辽东栎（Quercus wutaishanica）[20]和木奶果（Baccaurea ramiflora）[21]等树种的种子轻度脱水后，发芽率显著提高。本试验中，闽楠种子具有休眠特性，新鲜种子发芽率仅为22.33%；含水量降至33.72%时，种子生活力（56.67%）与未脱水前种子生活力无显著差异，种子发芽率（40.00%）显著高于未脱水前，表明轻微脱水能促进闽楠种子萌发。这可能是由于轻度脱水破坏闽楠种子中抑制种子萌发的物质结构，促使种子解除休眠状态，在生产实践中可以适当通风干燥，促进种子萌发。

顽拗性种子脱水过程中，膜脂过氧化作用致使膜结构损伤与功能被破坏，抗氧化保护系统活性下降，自由基的积累引发细胞代谢紊乱；MDA对细胞有毒害作用，会降低抗氧化保护酶的活性[22]。在种子脱水过程中，抗氧化防御系统发挥着重要作用，其中SOD、POD和CAT能够清除种子代谢过程中产生的自由基，保护细胞膜[22]。本试验中，含水量从35.53%降至33.72%时，电导率上升，SOD、POD和CAT活性增加，且SOD和CAT活性达到峰值，MDA含量下降；说明抗氧化酶系统发挥作用，在一定程度上清除MDA。含水量从33.72%降至31.22%时，电导率升至最大值，SOD活性先降后升，CAT活性下降，POD活性维持在较高水平，MDA含量先升后降。说明抗氧化酶系统对细胞膜系统有一定程度的修复作用。含水量低于31.22%时，电导率先降后升，SOD活性持续降低，POD和CAT活性较高，MDA含量增加。抗氧化酶在脱水前期能保持较高活性，在一定程度上缓解细胞膜系统的损伤；随脱水程度增加，闽楠种子膜脂过氧化程度不断加剧，细胞膜受损愈加严重，含水量过低时，抗氧化酶系统不再起作用。相关分析结果表明，种子生活力和发芽率与SOD活性呈显著正相关，与POD活性呈极显著负相关，CAT活性与种子生活力和发芽率相关性不显著，说明在闽楠种子脱水过程中，SOD对种子的保护作用更大。

3.2 结论

闽楠种子具有顽拗性，其储藏的最佳含水量为（33.72±0.69）%，种 子 安 全 含 水 量 为（32.17±0.35）%。在整个脱水过程中，SOD对维持闽楠种子活性作用较大。目前生产实践中通常采用湿沙储藏闽楠种子，保存期为3～4个月。虽然在保存过程中严格控制沙的湿度，但还有大量种子霉变腐烂。还需对闽楠种子脱水过程中的形态结构和生理生化机理进行更深入的研究，为探索其长期保存的方法提供参考。