超高效液相色谱串联质谱法快速测定猪肉中 9种β-受体激动剂的残留量

杨凤贤，杨焓妤

（文山州绿色食品发展中心，云南文山 663099）

β-受体激动剂，俗称瘦肉精，是具有苯乙醇胺结构的肾上腺素类的合成药物[1]。它既不属于兽药，也不属于添加剂，是肾上腺素类的神经兴奋剂，最初用来治疗肺科疾病和临床急救[2]，后来经常被不法商人掺杂在饲料中喂养畜禽，促进畜禽的快速增长，同时增加畜禽瘦肉的含量。由于高用药量导致高残留，人体食用含有“瘦肉精”残留的畜禽肉后会出现心情烦躁不安、头痛、心悸，并伴有疼痛等代谢紊乱和障碍性中毒症状，可诱发和加重心脑血管病人的病情，严重时还会导致死亡[3-4]。因此，世界各国都先后将其列为畜禽产品中禁用药物。

目前，国内外关于β-受体激动剂残留量检测标准及文献资料的报道较多，但大部分是用SPE方法净化，该方法操作步骤繁多，需耗费大量的人力、物力和时间等，而畜禽产品质量安全受到社会各界的高度重视，对畜禽产品中药物残留的监测力度和频度不断加强，因此有必要建立高效、快速、简便、灵敏的方法以应对大量的检测工作。本文采用QuEChERS[5-7]净化法对前处理条件进行优化，通过超高效液相色谱串联质谱检测，优选出猪肉中9种β-受体激动剂前处理的最优条件，为今后大批量β-受体激动剂残留量检测提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈（HPLC，美国Fisher公司）；甲醇（HPLC，美国Fisher公司）；乙酸铵（HPLC，aladdin公司）；氯化钠（AR，上海国药集团）；乙酸（HPLC，美国Sigma公司）；β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶（CNW）；纯净水（大理娃哈哈公司）。

标准溶液：氯丙那林、西马特罗、特布他林硫酸盐、妥布特罗、沙丁胺醇、克伦特罗、喷布特罗盐酸盐、莱克多巴胺盐酸盐和非诺特罗氢溴酸盐 （100 mg·L-1，坛墨质检科技股份有限公司）；内标溶 液：氯丙那林-D7同位素、西马特罗-D7同位素、妥布特罗-D9同位素、沙丁胺醇-D3同位素、克伦特罗-D9同位素、盐酸莱克多巴胺-D3同位素（100 mg·L-1， 坛墨质检科技股份有限公司）。

1.2 仪器与设备

AB SCIEX 3200QTRAP超高效液相色谱串联质谱联用仪（美国AB 公司）；MS 3 Basic 旋涡混合器（艾卡仪器设备有限公司）；ST16R 离心机（美国thermofisher）；SHA-CA水浴恒温振荡器（谷宁仪器有限公司）；AutoEVA-20Plus全自动平行浓缩仪（睿科集团股份有限公司）；SQP电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 混合标准储备液、内标储备液的配制

分别准确吸取0.1 mL各标准溶液、内标液置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容成浓度为1 mg·L-1的混合储备液，使用前用甲醇将储备液稀释，配制成浓度为0.1 mg·L-1的混合标准液、混合内标液。

1.3.2 样品前处理

（1）酶解。在50 mL离心管中准确称取猪肉样品（2±0.01）g，分别加入0.2 mol·L-1乙酸铵溶液（pH值5.2）8.0 mL、β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶 30 μL、0.1 mg·L-1混合内标液20 μL，再加入0.1 mg·L-1的混合标液，涡旋混匀，在37 ℃下避光水浴振荡（转速140 r·min-1）16 h。

（2）提取。酶解后将样品放置至室温，加15 mL乙腈和NaCl（饱和），涡旋混匀5 min，用8000 r·min-1高速离心5 min，将上清液转移至另一50 mL离心管内，再加入乙腈15 mL并涡旋混匀5 min，8000 r·min-1离心5 min后，将上清液一并转移至另一50 mL离心管内，加入正己烷10 mL并涡旋1 min，8000 r·min-1离心5 min，弃去正己烷层（上层），将乙腈层（下层）浓缩至干，用1∶1甲醇水溶液（含0.1%甲酸） 1.0 mL定容，用10000 r·min-1离心10 min后，过 0.22 μm有机滤膜，待UPLC-MS/MS测定。

1.3.3 标准工作曲线的制备

分别准确吸取0.1 mg·L-1的混合标准液，用1∶1甲醇水溶液（含0.1%甲酸）配制成浓度为0.5 μg·L-1、 1.0 μg·L-1、2.0 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1标 准系列溶液和2.0 μg·L-1内标溶液。

1.3.4 仪器工作条件

（1）液相色谱条件。色谱柱：Agilent C18（150 mm× 3.0 mm，3.5 μm）；流动相：有机相A为乙腈，水相B为含0.1%乙酸水溶液；梯度洗脱条件：0～3.00 min，4%A→30%A，3.00～5.30 min，30%A→96%A，5.30～7.02 min，96%A→4%A，7.02～10.00 min，4%A；流速：0.40 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。

（2）质谱条件。本试验采用ESI源，多反应监测正离子扫描模式。气帘气流速：25 L·h-1，雾化气流速：50 L·h-1，辅助气流速：60 L·h-1，辅助加热气温度：650 ℃，喷雾电压：5500 V。9种β-受体激动剂的质谱参数见表1。

表1 9种β-受体激动剂的质谱参数

1.3.5 正交试验设计

2 结果与分析

本文采用正交试验，设计3因素3水平条件，分别用不同的因素和水平对样品进行前处理，具体设计因素水平见表2，正交试验设计见表3。

2.1 线性范围、检出限和定量限

表2 正交设计因素水平表

表3 正交设计实验组合

用1∶1甲醇水溶液（含0.1%甲酸）配制不同浓度的9种β-受体激动剂标准溶液，通过峰面积对各兽药的浓度进行线性回归分析，并加入适当浓度的9种β-受体激动剂到猪肉空白基质中，通过采用上述的前处理方法和仪器测定方法，用3倍信噪比（S/N）和10倍信噪比（S/N）分别计算方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ）。如表4所示，9种β-受体激动剂在0.50～20.00 μg·L-1线性关系良好，相关系数r≥0.9991，均可满足猪肉中9种β-受体激动剂的测定需求。

2.2 回收率和精密度

在空白猪肉样品中添加标准溶液进行回收率试验，添加水平和提取条件见表2和3（每一加标水平和提取条件进行3次平行试验），采用超高效液相色谱/质谱检测，内标法和外标法定量，添加回收试验结果见表5，精密度（相对标准偏差）见 表6。

表4 9种β-受体激动剂的线性回归方程、相关系数、LOD和LOQ

表5 9种β-受体激动剂的添加回收试验结果（n=3）

表6 9种β-受体激动剂的相对标准偏差（n=3）

结果表明，添加浓度为2.5 μg·kg-1、提取次数为1次、提取体积为10 mL时，即1号、2号、3号、5号、6号和8号这6组样品中9种药物的平均回收率为18%～150%，相对标准偏差为0.8%～31.0%；而4号、7号和9号这3组样品中9种药物的平均回收率为53%～130%，相对标准偏差为0.4%～26.0%。根据实验室质量控制规范[8]要求，添加浓度为1～10 μg·kg-1时，测定值与真值的回收率偏差在-30%～+10%，RSD≤30%，因此，1号、2号、3号、5号、6号和8号这6组样品的检测结果更偏离规范要求，提取条件不被考虑。从人力、物力和仪器负荷等方面考虑，4号即添加浓度为1.0 μg·kg-1，提取次数为2次，提取体积为20 mL为本试验最优条件。

3 结论

本文对猪肉中9种β-受体激动剂的提取条件进行了优化，并采用超高效液相色谱-串联质谱法进行同时检测的方法。总体而言，克伦特罗、喷布特罗和非诺特罗3个化合物的回收率在所有提取条件下都在标准规定的范围[6]；而氯丙那林、西马特罗、特布他林、妥布特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺6个化合物的回收率在部分提取条件下满足标准规定的范围，部分提取条件下不满足标准规定的范围。9号即添加浓度水平5 μg·kg-1，提取次数为3次，每一次提取的体积为20 mL时，9种β-受体激动剂的回收率和精密度都满足标准规定的范围，但兽药添加浓度高，提取次数多，不但增加了人力和物力等成本，还增加了兽药对质谱仪的污染，所以，在大批量检测的情况下，不建议使用此条件。综合考虑各方面的情况，本试验最优的条件是4号，即添加浓度水平为1 μg·kg-1，提取次数为2次，每一次提取的体积为20 mL。