液相色谱-串联质谱法测定黄瓜中甲拌磷残留量的不确定度评定

张屹璇，余 浪*，杜丽思，阮宝慧，刘鹏芳，李彦芹

（1.云南智农高新技术有限公司，云南昆明 650600；2.云南云天化现代农业发展有限公司，云南昆明 650600）

甲拌磷是一种在本实验室内常规检测的农药。甲拌磷及其代谢物是一种高毒性农药，一旦人体过量摄入，则会导致神经系统紊乱、呼吸衰竭等[1]。《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》 （GB 2763—2016）[2]中规定，蔬菜中甲拌磷最高残留限量仅为0.01 mg·kg-1，因此保证测定结果的准确性就相当重要。在查阅大量文献后发现，气相色谱-质谱法测定芹菜中甲拌磷的不确定度评定已有报道[3]。另外，也有关于液相色谱-串联质谱法测定果蔬中吡虫啉、甲霜灵、多菌灵等农药残留量的不确定度评定的相关报道[4-6]，但具体的测定方法均与标准《食品安全国家标准 植物源性食品中331种农药及其代谢物残留量的测定 液相色谱-质谱联用法》（GB 23200.121—2021）[7]不同。另一方面，采用标准GB 23200.121—2021测定果蔬中甲拌磷残留量的不确定度评定未见报道。

本实验室严格按照国家标准GB 23200.121—2021测定阳性黄瓜样品中甲拌磷的残留量，在称量样品后，用乙腈试剂匀浆提取，加入QuEChERS盐包，通过盐析离心，取上层清液，经QuEChERS净化管净化，过有机相微孔滤膜后，装入进样小瓶中，用液相色谱-质谱联用仪检测，采用外标法定量。本实验参照《化学分析测量不确定度评定》 （JJF 1135—2005）[8]以及《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[9]对整个测定过程中有可能产生的不确定度进行来源分析和对应数据的计算，为本实验室农药残留检测质量控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲拌磷阴性和阳性黄瓜样品。

乙腈（HPLC，Merck）；甲醇（HPLC，Merck）； 甲酸（HPLC，Thermo）；甲醇中甲拌磷溶液标准物质（1000 μg·mL-1，坛墨质检）；QuEChERS萃取盐包（Agilent）；QuEChERS通用型净化管（Agilent）。

1.2 仪器与设备

液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（AB SCIEX Triple Quad 4500）；多功能高速离心机（Beckman Allegra X-30）；均质机（IKA T25）；电子天平（METTLER TOLEDO ME204）；Polar C18色谱柱（100 mm ×2.1 mm，2.6 μm）；漩涡混匀器（IKA MS 3）。

1.3 实验方法

1.3.1 标准储备液和中间溶液的配制

（1）100 μg·mL-1甲拌磷标准储备溶液。用1 mL的A级单标线移液管准确吸取甲拌磷标准物质1.0 mL 于10 mL容量瓶中，用乙腈溶剂定容至刻度，塞紧瓶盖摇匀后，于4 ℃冰箱避光保存。

（2）1 μg·mL-1甲拌磷标准中间溶液。用0.1 mL 的A级刻度移液管准确吸取甲拌磷标准储备液0.1 mL 于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，于4 ℃ 冰箱避光保存。

（3）基质匹配标准曲线的配制。通过同样的前处理过程处理空白阴性的黄瓜样品获得空白基质液。分别将0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、0.70 mL 和1.00 mL甲拌磷标准中间溶液准确吸取至10 mL 容量瓶中，用空白基质液定容，配制成0.005 ng·mL-1、 0.010 ng·mL-1、0.020 ng·mL-1、0.050 ng·mL-1、 0.070 ng·mL-1和0.100 ng·mL-1的系列标准溶液。以甲拌磷质量浓度C为横坐标，以甲拌磷定量离子峰面积AS为纵坐标，进行一元线性拟合，得到标准曲线。

1.3.2 样品前处理

（1）提取。准确称量10 g（精确至0.01 g）样品于50 mL离心管中，用10 mL刻度移液管吸取10 mL乙腈，再加入1颗陶瓷均质子，剧烈振荡1 min后，打开盖子加入4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠、l g柠檬酸钠二水合物以及0.5 g柠檬酸二钠盐倍半水合物（本次实验使用安捷伦成品提取盐包），剧烈振荡1 min后，在4200 r·min-1的条件下离心5 min。

（2）净化。吸取6 mL上清液至内含除水剂和净化材料的塑料离心管中（本次实验使用安捷伦耗材： 900 mg无水硫酸镁、150 mg PSA），涡旋混匀1 min。 4200 r·min-1离心5 min后，用塑料吸管吸取上清液，过有机微孔滤膜后装入进样瓶中，待测定。

1.3.3 色谱及质谱条件

（1）色谱条件。流动相A：水（含有1‰甲酸）；流动相B：甲醇；流速：0.3 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：1 μL；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

（2）质谱条件。离子源类型：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；离子源温度：500 ℃；电喷雾电压：5500 ℃；辅助加热气：50 psi；雾化气压力：50 psi；气帘气压力：35 psi；监测方式：多反应监测。甲拌磷的质谱参数见表2。

1.3.4 数学模型的建立

检测样品中甲拌磷残留量的计算公式为

式中：X为试样中甲拌磷的残留量，mg·kg-1；C为样品中的质量浓度，mg·L-1；V为提取液体积， mL；m为试样质量，g。

表2 甲拌磷的保留时间及质谱参数

2 结果与分析

2.1 不确定度分量的来源

通过前处理的全过程和数学模型来看，通过本方法测定黄瓜样品中甲拌磷农药残留的不确定度主要来自于5个方面：样品在称量的过程中通过万分之一天平引入的相对标准不确定度urel(M)；样品在前处理的过程中因为提取液乙腈溶液的体积变化而引入的相对标准不确定度urel(V)；标准溶液及其配制全过程中因体积变化而引入的相对标准不确定度urel(P)；标准曲线在仪器上拟合的过程中引入的相对标准不确定度urel(S)；加标阳性样品在重复测定过程中引入的相对标准不确定度ure1(W)。

2.2 不确定度各分量的评定

2.2.1 样品称量引入的相对标准不确定度urel(M)

称量时，通过天平称取黄瓜样品10.00 g，称量允许误差为±0.5 mg，按矩形分布计算，，根据不确定度的B类评定，在称样的时候，由样品的称样量误差引入的相对标准不确定度urel(M)为

2.2.2 样品在整个前处理过程中提取液体积变化引入的相对标准不确定度urel(V)

（1）提取时加入的乙腈提取液总体积而引入的相对标准不确定度urel(Vt)。

《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）[10]规定，在实验室常规室温为20 ℃时，10 mL的A级分度吸量管分取10.0 mL乙腈允差为±0.050 mL。 据不确定度的B类评定，单标线吸量管允差引起的体积相对标准不确定度urel(Vt1)为

因此，在提取时加入的乙腈总体积引入的相对标准不确定度ure1(Vt)为

（2）分取6 mL乙腈时引入的相对标准不确定度urel(Vf)。用1支10 mL分度吸量管移取6.00 mL乙腈提取液，A级10 mL分度吸量管的容量允许误差为±0.050 mL，则由于分取液体使用的分度吸量管允差引起的体积相对标准不确定度urel(Vf1)为

因此，分取6 mL乙腈的体积时引入的相对标准不确定度ure1(Vf)为

则样品在整个前处理过程中由于乙腈提取液溶液总体积变化而引入的相对标准不确定度urel(V)为

2.2.3 标准溶液在配制的过程中引入的不确定度urel(P)

标准溶液在整个配制过程中共有3个过程可引入不确定度，分别为甲拌磷标准物质的原液引入的相对标准不确定度urel(C0)；由分度吸量管在吸取标液时引入的相对标准不确定度为urel(Vy)；由10 mL容量瓶在定容时引入的相对标准不确定度 为urel(Vr)。

（1）甲拌磷标准物质的原液引入的相对标准不确定度urel(C0)。根据甲拌磷的标准物质证书，甲拌磷标准物质原液的浓度C0为1000 μg·mL-1，其扩展不确定度为0.02 μg·mL-1，，则甲拌磷标准物质的原液引入的相对标准不确定urel(C0)为

（2）甲拌磷的标准储备液在配制过程中，通过移液管引入的不确定度urel(Vc)。实验使用1 mL单线标吸量管，，据《常用玻璃量器检定规程》 （JJG 196—2006），1 mL A级单线标吸量管的容量允许差为0.007 mL，则标准储备液在配制过程中通过单线标吸量管引入的相对标准不确定度urel(Vc1)为

实验室的环境温度在（20±5） ℃内波动，按照矩形分布来计算，，溶剂乙腈的膨胀系数为1.37×10-3℃-1，假设温度变化是均匀分布的，则由实验室温度变化引入的相对标准不确定度urel(Vc2)为

甲拌磷的标准储备液在配制过程中引入的不确定度urel(Vc)为

（3）甲拌磷的标准中间液在配制过程引入的不确定度urel(Vz)。实验使用0.1 mL分度吸量管，，据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）， 0.1 mL A级分度标吸量管的容量允许差为0.002 mL。 则标准中间液在配制过程中使用1次分度吸量管引入的相对标准不确定度urel(Vz1)为

（4）甲拌磷的标准曲线液在配制的过程引入的不确定度urel(Vq)。实验使用1 mL分度吸量管，分度吸量管按矩形分布计算，，据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006），1 mL分度吸量管容量允许差为0.008 mL。使用4次1 mL分度吸量管引入的相对标准不确定度urel(Vq1)为

实验使用0.1 mL分度吸量管，分度吸量管按矩形分布计算，，据《常用玻璃量器检定规程》 （JJG 196—2006），0.1 mL的A级分度标吸量管的容量允许差为0.002 mL。使用2次0.1 mL分度吸量管引入的相对标准不确定度urel(Vq3)为

实验室环境温度在（20±5） ℃内波动，按矩形分布计算，，溶剂乙腈的膨胀系数为1.37× 10-3℃-1，则由实验室温度变化引入的相对标准不确定度urel(Vq4)为

甲拌磷的标准曲线液在配制过程引入的相对标准不确定度urel(Vq)为

所以在整个配制的过程中由于分度吸量管引入的相对合成标准不确定度urel(Vy)为

（5）标准溶液在配制的过程中由于使用容量瓶而引入的不确定度urel(Vr)。

在配制标准工作液的过程中由容量瓶引入的相对标准不确定度urel(Vr)为

则在标准溶液的配制过程中引入的相对标准不确定度urel(P)为

2.2.4 标准曲线在拟合的过程中引入的不确定度urel(S)

本方法为外标法定量，整个过程就是将标准曲线的每个浓度点连续进样3次，峰面积和浓度结果见表3，最终得到的线性方程为y=9625.90877x+ 158.51554 （r=0.99973，r2=0.99946）。

以拟合的标准曲线为定量标准，对加过标的阳性黄瓜样品进行了6次测定，结果如表4所示。

通过得出的标准曲线，计算实际阳性样品的浓度含量时，产生的标准不确定度计算公式为

式中：Sy/c为工作曲线的标准偏差，Sy/c=0.1；a为回归系数，a=9625.91；p为样品上机连续测定次数，p=6；n为所配标准溶液点个数，n=6；m为标准溶液重复测定的次数，m=3；为曲线各点的平均质量浓度，=42.5 μg·mL-1；

则曲线在拟合的过程引入的相对标准不确定度urel(S)为

表4 样品测量结果

2.2.5 样品重复测定引入的不确定度urel(W)

本实验由同一名实验者在同一实验条件下，完全按照相同的上述实验步骤进行前处理，实验过程中用到的试剂、耗材和标准品均为同一批次，在非常短的时间内反复测定黄瓜样品中的甲拌磷含量，在经过6次测定之后，已满足结果评定的重复性条件。将本次实验前处理过程中涡旋的速率和匀浆的速率等因素引入的不确定度分量全部合并为总的实验重复性不确定度分量，最终结果通过贝塞尔公式计算，可以得到A类评定的数值。

采用贝塞尔公式计算标准偏差S为

采取6次平行重复测定的数值计算其算术平均值，作为阳性黄瓜样品中甲拌磷的含量。其标准不确定度u(W)为

阳性黄瓜样品通过不断重复测定，在检测过程中引入的相对标准不确定度urel(W)为

2.3 测量不确定度的评定

2.3.1 合成相对标准不确定度urel(X)

在检测过程中的合成相对标准不确定度urel(X)为

2.3.2 相对扩展不确定度

95%置信水平下，取k=2，则相对扩展不确定度uGC为

2.3.3 扩展不确定度

2.3.4 结果表示

用QuEChERS的前处理方法进行实验，通过液相色谱-三重四极杆串联质谱法测定黄瓜中甲拌磷，结果为（0.01756±0.0035）mg·kg-1；k=2。

3 结论

综上，影响黄瓜中的甲拌磷农药残留测量结果的不确定度最大的分量为标准溶液在整个配制过程中由于使用玻璃量器和环境温度变化而引入的不确定度，其次是样品前处理过程引入的不确定度、样品重复测量引入的不确定度、标准溶液在检测仪器上拟合成曲线的时候引入的不确定度，最后则是样品称样引入的不确定度。综上所述，在采用国标GB 23200.121—2021测定蔬果中的农药及其代谢物的残留量时，应当非常严格地按照操作规程操作，在称样的时候做好天平使用记录，并定期对天平进行检定；应当购买合格标准物质，使用的玻璃量器也必须进行严格检定；在样品上机的过程中做好仪器使用记录并定期对仪器进行期间核查，确保在整个测量期间维持相对稳定的工作状态。另外，确保从称样到上机的全流程都有痕迹可复核，每个环节都要做到尽可能的精确，才能降低检测结果的不确 定度。