不同严重程度急性呼吸窘迫综合征患者血液生物代谢组学研究

徐俊南 周培森 胡公义 徐慧

急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是指由各种肺内和肺外致病因素导致的急性弥漫性肺损伤和进而发展的急性呼吸衰竭，临床表现以进行性呼吸窘迫、顽固性低氧血症和非心源性肺水肿为特征［1］。研究表明，早期、快速明确ARDS诊断，对改善预后、降低病死率具有重大意义，但目前尚无特异性高的早期诊断及预后评估生物标志物。代谢组学是对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与病理生理变化的相对关系研究方式，其在安全性评价、毒性标志物的筛选、疾病诊断等生命科学领域均有广泛应用［2］。本研究应用代谢组学技术筛选和检测ARDS患者潜在的内源性标志物，观察其病理生理变化时引起的机体关键代谢过程中内源性物质的比例和浓度变化，描绘出这些代谢物的变化信息在ARDS患者发病过程中特征性的化学痕迹。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2018年1月至2021年12月本院住院治疗的ARDS患者47例，男27例，女20例；年龄（55.3±10.5）岁。纳入标准：①有明确诱因1周内出现的急性或进展性呼吸困难；②胸部X线平片或胸部CT显示双肺浸润影，不能完全用胸腔积液、肺叶/全肺不张或结节影解释；③呼吸衰竭不能完全用心力衰竭或体液超负荷解释；④低氧血症：氧合指数（PaO2/FiO2）≤300 mmHg且呼吸机机械通气参数PEEP/CPAP不低于5 cmH2O。排除标准：①年龄＜18或＞80岁；②发病时间＞1周；③明确心功能不全4级以上或已证实为心源性肺水肿；④入院后24 h内治疗中断或出院、死亡的患者；⑤妊娠等。患者分别于入院后12 h内及好转出院时采肘静脉血，离心后提取血浆，-70℃冰箱储存备用。将符合上述标准的患者根据氧合指数进行分组：轻度组：200 mmHg＜氧合指数≤300 mmHg；中度组：100 mmHg＜氧合指数≤200 mmHg；重度组：氧合指数≤100 mmHg。另选取同期本院体检的健康者51例为对照组，其中男28例，女23例；年龄（54.1±11.1）岁。所有患者均由患者家属或代理人签署知情同意书，两组性别、年龄等一般资料差异无统计学意义。

1.2 方法 （1）常规实验室生化指标检测分析：全自动生化分析仪检测检测各组人群血清白细胞计数（WBC）、血红蛋白（Hb）、血小板（PLT）、国际标准比比值（INR）、谷丙转氨酶（ALT）、肌酐（Sr），白蛋白（Alb）和血氨等生化指标。（2）超液相色谱串联质谱联用技术分析（UPLC-MS/MS）①仪器与条件：采用仪器为ACQUITY UPLC和XEVO TQS-micro三重四级杆超液相色谱串联质谱联用仪（产地：Waters公司，美国）。色谱柱UPLC HSS C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）分离，柱温调整为40 ℃，不断优化色谱条件，使色谱峰充分分离，标记信噪比＞10的色谱峰，并进行峰面积积分测算。②样本采集与处理：分别采集健康体检人群及ARDS患者入院后12 h内及出院时肘静脉全血5 mL，3,000 r/min离心10 min取上清液（血浆），-80℃冰箱保存，供UPLC-MS/MS分析检测。取100 μL血浆样品置入1.5 mL EP管中，加入乙腈300 μL，涡旋混合1.0 min，13,000 r/min高速低温（4℃）离心10 min，取上清液100 μL于进样瓶中备用，每次取2 μL样本量用于UPLC-MS/MS检测分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计软件。符合正态分布计量资料以（±s）表示，用t检验；偏态分布两组间比较采用秩和检验；计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者血气分析与生化分析结果比较 与对照组比较，ARDS组患者PaO2水平明显降低，总胆红素水平升高，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 两组患者血气分析及生化指标比较（±s）

表1 两组患者血气分析及生化指标比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别 pH PaO2 PaCO2 ALT 总胆红素 Alb Sr对照组（n=51）7.39±0.04 95.4±2.8 40.6±2.2 37.8±10.114.4±3.9 40±5.0 68.6±8.2 ARDS组（n=47）7.37±0.1 70.23±9.9*41.4±6.27 39.4±9.8 34.3±8.9*38.2±4.7 80±6.9

2.2 ARDS患者与正常人群血清代谢产物分析比较 与对照组比较，ARDS组患者血清中丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、牛磺酸、酪氨酸和谷氨酸明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组患者血清代谢产物改变情况比较（±s）

表2 两组患者血清代谢产物改变情况比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

代谢产物 对照组（n=51） ARDS组（n=47）丙氨酸 0.428±0.076 0.471±0.059**苯丙氨酸 0.523±0.072 0.532±0.082赖氨酸 0.511±0.076 0.577±0.092**丝氨酸 0.486±0.080 0.495±0.063精氨酸 0.251±0.070 0.290±0.092*脯氨酸 0.772±0.075 0.863±0.096**苏氨酸 0.694±0.076 0.772±0.099*乙酰丙酸 0.789±0.079 0.814±0.086牛磺酸 0.304±0.085 0.364±0.109**酪氨酸 0.688±0.067 0.720±0.067*谷氨酸 0.702±0.080 0.960±0.112**

2.3 不同严重程度ARDS患者血清代谢产物分析比较 与轻度组比较，中度组、重度组ARDS患者血清中赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、牛磺酸、谷氨酸明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 不同严重程度ARDS患者血清代谢产物比较（±s）

表3 不同严重程度ARDS患者血清代谢产物比较（±s）

注：*P＜0.05，**P＜0.01

代谢产物 轻度组（n=24） 中度组（n=15） 重度组（n=8）丙氨酸 0.450±0.046 0.486±0.060 0.503±0.072苯丙氨酸 0.512±0.084 0.530±0.073 0.594±0.067赖氨酸 0.526±0.065 0.587±0.054* 0.715±0.069**丝氨酸 0.487±0.069 0.491±0.052 0.525±0.062精氨酸 0.240±0.070 0.307±0.070* 0.407±0.072*脯氨酸 0.794±0.069 0.920±0.068** 0.960±0.037*苏氨酸 0.712±0.092 0.811±0.053** 0.882±0.036*乙酰丙酸 0.791±0.078 0.831±0.103 0.848±0.065牛磺酸 0.296±0.086 0.393±0.068** 0.516±0.031**酪氨酸 0.698±0.075 0.735±0.054 0.758±0.037谷氨酸 0.881±0.075 1.016±0.071** 1.090±0.079*

2.4 重度ARDS患者入院时与出院时血清代谢产物分析比较 与入院时比较，出院时重度ARDS患者血清中赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、牛磺酸、谷氨酸表达明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 重度ARDS患者入院和出院时血清代谢产物比较（±s）

表4 重度ARDS患者入院和出院时血清代谢产物比较（±s）

代谢产物 入院时 出院时 P值赖氨酸 0.715±0.069 0.513±0.099 0.001精氨酸 0.407±0.072 0.210±0.060 ＜0.001脯氨酸 0.960±0.037 0.736±0.101 ＜0.001苏氨酸 0.882±0.036 0.625±0.117 0.001牛磺酸 0.516±0.031 0.301±0.046 ＜0.001谷氨酸 1.090±0.079 0.779±0.093 ＜0.001

3 讨论

近年来，对ARDS防治进行了大量的研究，包括俯卧位通气、肺保护性通气以及综合性对症支持治疗等对ARDS患者预后具有重要意义［3］。但仍有部分研究报道ARDS患者病死率达40%以上［4］。早期准确诊断并给予强有力干预是当前防治的重要途径。而目前缺少ARDS的特异性诊断方法，现有的诊断标准较为复杂，临床实际应用具有一定的困难。本研究结果显示，常规血液检查中仅氧分压和胆红素水平在ARDS患者中比对照组明显升高。UPLC-MS / MS检测能够高效、灵敏、准确探索分析未知化合物，对疾病的早期诊断、预测具有重要意义［5-6］。本研究采用UPLC-MS / MS技术检测ARDS患者和正常人群血清成分，共检测出11种代谢物，其中丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、牛磺酸、酪氨酸和谷氨酸水平明显升高。进一步对ARDS患者进行分层发现，中、重度组ARDS患者较轻度组患者血清中赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、牛磺酸和谷氨酸明显升高。

谷氨酸属于兴奋性神经递质，在急性肺损伤中具有重要作用。谷氨酸激动剂N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）通过肺泡毛细血管区域NMDA受体介导兴奋毒性从而引起肺水肿。谷氨酸信号可以引起一氧化氮（NO）的产生和细胞凋亡。进一步研究谷氨酸信号在肺毒性中的生理作用可以揭示ARDS的更多机制。ARDS本质是多种炎症细胞（巨噬细胞、中性粒细胞、血小板内皮细胞、血小板）及其释放的炎症介质和细胞因子间接介导的肺脏炎症反应，引起肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤，肺泡膜通透性增加，引起肺间质和肺泡水肿［7］。研究表明，高浓度牛磺酸可能会降低ARDS发病过程中的自由基产生［8］。牛磺酸是嗜中性粒细胞中的一种内源性含硫氨基酸，具有抗炎特性的抗氧化剂的保护作用。牛磺酸可能通过减弱中性粒细胞与内皮的相互作用来减轻白介素-2诱导的肺损伤。因此，牛磺酸在ARDS中的升高是抑制炎症反应的一个指标。精氨酸是NO的唯一生物合成前体。精氨酸上调可能与人体防御机制有关，增加NO从而缓解与缺氧相关的疾病。赖氨酸水平在ARDS中升高，可能在ARDS中具有防御作用。研究表明，其具有减少NO作用，能够增加血管抵抗力［9］。苏氨酸是一种糖异生氨基酸，与脓毒症有关。其通过产生抗体来调节免疫反应，触发淋巴细胞增殖，在抑制细胞凋亡中起着重要作用。脯氨酸是一种蛋白质生成的仲氨基酸，在炎症微环境中作为应激底物发挥着相关作用。据报道，慢性肺疾病的气道重塑会产生脯氨酸［10］。

上述代谢产物有助于确定不同严重程度的ARDS患者状态。对ARDS的诊断及病情评估具有重要意义，但仍需要进一步大量样本前瞻性的验证。