免疫组化检测与RNA 原位杂交检测三阴性乳腺癌组织程序死亡受体1 一致性研究

郭一君，刘 丹，何 淼，吕晨光

北部战区总医院 普通外科，辽宁 沈阳 110016

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤［1-2］。三阴性乳腺癌（triple negative breast carcinoma，TNBC）患者的雌激素受体、孕激素及人表皮生长因子受体2 均呈现出阴性［3］。TNBC患者约占乳腺癌患者的15%，预后较其他类型乳腺癌患者预后差［4］。程序死亡受体1（programmed cell death 1，PD-1）是诊断和治疗TNBC 新的突破口［5］。PD-1 为细胞表面膜的膜蛋白之一，是T 细胞与B 细胞表面的抑制性信号受体，与T 细胞表面程序性死亡-受体1（programmed death-gland1，PD-L1）相结合，具有抑制T 淋巴细胞免疫功能的作用，使肿瘤无法被免疫监视［6］。本研究采用免疫组化检测（immuno-histochemistry，IHC）与RNA 原位杂交（RNA in situ hybridization，RNAscope）检测PD-1 水平，分析并判断两种方法的一致性与优劣。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取自2019 年3 月到2021 年4 月北部战区总医院收治的62 例TNBC 患者为研究对象。患者年龄40～70 岁；根据乳腺癌组织学分级分为Ⅲ级20 例，Ⅱ级11 例；伴大汗腺分化癌5 例，伴髓样癌4 例，浸润性小叶癌5 例，腺样囊性癌4 例，化生性癌5 例，腺泡细胞癌7 例，低级别腺鳞癌1 例。纳入标准：检查前均为接受乳腺癌手术治疗；病理学检查为原发性乳腺癌；符合《乳腺癌雌、孕激素受体免疫组化学检测指南》［7］及《乳腺癌外科学》［8］相关的TNBC 诊断标准。排除标准：合并有心、肝、肾等脏器肿瘤；合并凝血功能障碍；患有精神类疾病且交流沟通障碍。

1.2 研究方法 分别运用IHC 和RNAscope 检测PD-1 状态。石蜡组织进行切片为5 μm，使用二甲苯脱蜡15 min，使用100%、95%、85%、75%乙醇的梯度酒精脱二甲苯6 min，使用流动自来水反复冲洗，进行微波抗原修复，加入过氧化氢阻断液，降低内源性过氧化物酶。加入PD-1（鼠抗人，克隆号UMAB187）抗体，用3，3-二氨基联苯胺溶液显色。将切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树脂封固。RNA 原位杂交检测探针来自南京钟鼎生物技术有限公司，荧光标记PD-1mRNA。比较RNAscope 与IHC 结果。根据细胞质或细胞核中有棕色标点判读RNA 原位杂交结果：1～10 个点为1 分，10～15 个点记为2 分，15～20 个点记为3 分，棕色标点＞20 个点记为4 分，分数≥1 分为抗体表达阳性。IHC 检测结果判读：细胞膜或细胞质出现棕色黄色反应≥5%为阳性，出现棕色黄色反应＜5%为阴性。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。计数资料以例（百分率）表示，组间比较采用χ2检验、Kappa检验。Kappa ＞0.75 为一致性好，0.4 ≤Kappa ＜0.75 为一致性一般，Kappa ＜0.40 为一致性差。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者IHC、RNAscope 检测结果 IHC 检测方法定位于细胞膜，检测阳性患者占83.9%（52/62），阴性患者占16.1%（10/62）。RNAscope 定位于细胞核与细胞质，检测阳性率为91.9%（57/62），阴性率为8.1%（5/62）。

2.2 IHC 与RNAscope 检测一致性 RNAscope检测与IHC检测结果相关性Kappa=0.758（P ＜0.05）。IHC 与RNAscope 检测一致性较强。

3 讨论

TNBC 病死率高、且容易复发，约占我国乳腺癌患者的15%，主要为绝经前女性［9］。TNBC 常见于年轻女性，40 岁以下女性患有TNBC 的风险是50 岁以上女性的2 倍，据美国癌症协会统计，每年约有26 万女性被诊断为乳腺癌，其中15%～20%患有TNBC，且发病率呈明显上升趋势［10］。

TNBC 多呈单发小肿块，晚期可出现“酒窝征”、“橘皮样变”、皮肤溃疡、淋巴结肿大。部分患者可见远处转移，侵犯肺、肝、脑等脏器。乳腺癌的影像学表现与病理学预后指标之间存在一定关联，TNBC 为高侵袭性的肿瘤，超声检查能有效观测内部回声与血流情况。对于TNBC 患者的诊断，应综合分析临床病理及影响学特征，结合不同患者的自身情况制定个体化诊疗方案，降低临床诊断的假阳性或假阴性率，切实提高TNBC 患者诊断准确率。

有研究表明，PD-1 是细胞表面膜蛋白，能与肿瘤细胞配体PD-L1 结合，降低T 细胞的分化、增殖，但调节性T 细胞活性得到激活，机体对肿瘤细胞的杀伤效益被削弱［11］。这为临床工作者提供治疗思路：可通过抑制肿瘤表面的PD-1，减少对免疫系统的影响。靶向PD-1 治疗也是TNBC治疗的重要方法。目前检查PD-1 的方法有多种，本研究选择RNAscope 检测与IHC。IHC 诊断效果显著，但在肿瘤分辨中有一定的局限性，依赖于抗体［12］。RNAscope 技术是一种新型RNA 原位杂交技术，在6～8 h 即可完成，可进行单染色和多重染色、操作流程简单，能有效了解肿瘤异质性，分析基因的表达情况。RNAscope 在临床检验诊断上具有高度敏感性，根据碱基互补配对原理对特定基因的mRNA 水平进行检测［13］。HC 检测方法定位于细胞膜，检测阳性患者占83.9%（52/62），阴性患者占16.1%（10/62）。RNAscope 定位于细胞核与细胞质，检测阳性率为91.9%（57/62），阴性率为8.1%（5/62）。RNAscope 检测与IHC检测结果相关性Kappa=0.758（P＜0.05），IHC 与RNAscope检测一致性较强。临床工作者诊断 TNBC 时可使用IHC 与RNAscope 联合检测PD-1。

综上所述，IHC 与RNAscope 检测TNBC 效果较好，且IHC 和RNAscope 检测PD-1 一致性较强。