响应面优化超声辅助法提取奇亚籽中咖啡酸及其抗氧化性测定

侯笑林,项立譞,李明珠,冯金晓

响应面优化超声辅助法提取奇亚籽中咖啡酸及其抗氧化性测定

侯笑林,项立譞,李明珠*,冯金晓

青岛工学院食品工程学院, 山东 青岛 266300

咖啡酸是天然的抗氧化剂，在化妆品和医药领域有广泛的应用，其具有多种生物活性，未来也可作为食品添加剂在食品领域得到应用。本研究采用超声波辅助乙醇法提取奇亚籽中咖啡酸，通过单因素试验及响应面优化试验对咖啡酸的提取工艺进行优化，同时对咖啡酸进行抗氧化性研究。结果表明：当乙醇浓度为82%，提取时间为26 min、提取温度为62 ℃、料液比为1:20（g∙mL-1）时，奇亚籽中咖啡酸提取量为656.475 mg∙g-1。咖啡酸对DPPH自由基和羟基自由基清除能力随着咖啡酸浓度的增加而提高，清除能力高于对照品VC，当质量浓度达到0.25 mg∙mL-1时，最高清除率分别为69.18%和75.32%，具有较强的抗氧化能力。

奇亚籽; 咖啡酸; 抗氧化性

奇亚籽是仅次于玉米、大豆的第三大粮食作物[1]，富含人体必需脂肪酸及多种抗氧化活性成分，并含有丰富的膳食纤维、蛋白质、维生素、矿物质等[2]，在抗氧化[3]、调节血脂代谢、抑制肥胖、改善心血管[4]等方面发挥了重要作用。咖啡酸广泛分布于茵陈、菜蓟、金银花等多种中药植物中，属于酚酸类化合物，具有抗菌、抗炎[5]、降脂降糖、免疫调节、细胞损失保护[6]、利胆止血及抗氧化[7]等药理作用。因其可以影响食物的色泽、稳定性、风味、营养价值从而在食品加工领域也有广泛应用，近年来逐渐成为研究的热点，其在化妆品和医药领域也备受青睐[8]。目前，国内关于奇亚籽的研究主要集中在食品的加工、奇亚籽蛋白及多糖的提取以及奇亚籽油的加工工艺优化、品质及性能提升等方面[9]，而关于奇亚籽中其他活性成分的提取及性能研究则鲜有报道。试验探究超声波辅助乙醇提取法提取奇亚籽中的咖啡酸，通过响应面法对咖啡酸的提取工艺进行优化，并对咖啡酸的抗氧化性进行测定，以期为咖啡酸应用于食品抗氧化领域，延长食品保存期，服务于区域农业产业经济发展提供一定的理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

奇亚籽：安徽省沂泽生物科技有限公司；95%乙醇：天津市致远化学试剂有限公司；DPPH：合肥巴斯夫生物科技有限公司；L-抗坏血酸：上海埃彼化学试剂有限公司；水杨酸：上海埃彼化学试剂有限公司；硫酸亚铁：天津市永大化学试剂有限公司；咖啡酸标准品：润友化学有限公司。

1.2 仪器与设备

1.3 试验方法

1.3.1 咖啡酸的提取及测定（1）标准品溶液的制备精密称取咖啡酸标准品2.000 g，置于50 mL的棕色容量瓶中，加乙醇溶液定容至刻度，摇匀，制成浓度为0.04 g∙mL-1的标准品溶液，精密吸取咖啡酸标准品溶液，加入乙醇溶液定容至刻度，分别稀释为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg∙mL-1的标准溶液于棕色量瓶中，在325 nm处测定其吸光度值，制定标准曲线[10]。

（2）样品溶液的制备及测定将奇亚籽放入粉碎机进行干法粉碎，过60目筛。准确称量奇亚籽细粉2.00 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，精确加入80%的乙醇溶液20.00 mL，密塞，摇匀，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，取出，放冷，再称定质量，用80%乙醇溶液补足减失的质量，摇匀，离心，取上清液，过滤，滤液置棕色量瓶中，即得样品溶液，在325 nm处测定其吸光度值，得出咖啡酸浓度。

（3）奇亚籽中咖啡酸含量的计算方法咖啡酸提取量（mg∙g-1）=×/×100

为咖啡酸质量浓度（mg∙mL-1）；为提取液体积（mL）；为奇亚籽质量（g）。

（4）奇亚籽中咖啡酸提取单因素试验设计以咖啡酸提取量为评价指标，研究不同乙醇浓度、提取温度、提取时间及料液比对奇亚籽中咖啡酸提取量的影响。每个水平设置3次重复。

（5）奇亚籽中咖啡酸提取响应面优化试验设计在单因素试验的基础上，利用Design Expert软件Box-Behnken中心组合试验设计[11,12]，对奇亚籽中咖啡酸提取工艺进行优化，确定最优提取工艺。

表 1 响应面试验因子水平表

1.3.2 咖啡酸抗氧化性测定（1）咖啡酸DPPH•清除作用测定取不同质量浓度样品溶液4.0 mL于试管中，依次加入2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，25 ℃水浴中反应20 min，在517 nm处测定吸光度(Ai)。以蒸馏水做空白。以相同浓度VC作对比。每个浓度设置3次重复。

常用者为头孢克洛（希刻劳）、头孢呋辛，对革兰阳性球菌的活性与第一代相仿或略差，对部分革兰阴性杆菌亦具有抗菌活性。

清除率%=[1-(1-2)/3]×100%

1：4.0 mL样液+2.0 mL DPPH对应吸光度值；2：4.0 mL样液+2.0 mL 95％的乙醇对应吸光度值；3：4.0 mL蒸馏水+2.0 mL DPPH对应吸光度值。

（2）咖啡酸•OH清除作用测定根据Fenton反应体系模型，在反应体系中加入具有清除•OH的物质，与水杨酸竞争•OH，使有色物质生成量减少。在相同体积反应体系中加入不同浓度的奇亚籽咖啡酸溶液，用蒸馏水做空白，在510 nm处测定吸光度，计算出不同浓度奇亚籽咖啡酸清除•OH的能力。以相同浓度VC作对比。每个浓度设置3次重复。

清除率/%=[1-(1-2)/3]×100%

1：0.5 mL水杨酸-乙醇+1.0 mL样液+0.5 mL Fe2SO4++5.0 mL H2O2对应吸光度值；2：0.5 mL水杨酸-乙醇+1.0 mL样液+0.5 mL蒸馏水+5.0 mL H2O2对应吸光度值；3：0.5 mL水杨酸-乙醇+1.0 mL蒸馏水+0.5 mL Fe2SO4+5.0 mL H2O2对应吸光度值。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制备

以咖啡酸标准品的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为=0.9336-0.0013，2=0.9997。结果表明，咖啡酸的浓度在0.2～1.0 mg∙mL-1范围内与所测得的吸光度值呈良好的线性关系。

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇溶液浓度对奇亚籽咖啡酸提取量的影响如图1所示，随着乙醇溶液浓度逐渐增加，溶剂极性逐渐降低，物质间氢键更容易被破坏，使得咖啡酸提取量随着乙醇溶液浓度的增大而增加，在85%时提取效果最好。但随着乙醇溶液浓度继续增大，由于一些醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分溶出，与咖啡酸形成竞争作用，从而导致乙醇溶液浓度在85%～95%范围内呈下降趋势。因此咖啡酸适宜提取乙醇溶液浓度为85%。

图 1 乙醇浓度对咖啡酸提取量影响

2.2.2 提取温度对奇亚籽咖啡酸提取量的影响如图2所示，温度升高有助于提高底物相溶性，并改善传质，从而使咖啡酸溶解度变大，因此咖啡酸提取量随着提取温度的升高呈现增加趋势，且在60 ℃时达到最大值。若温度继续升高，由于咖啡酸中大量的羧基、双键和酚羟基在长时间高温下易分解、氧化和异构化，使得咖啡酸提取量逐渐下降。因此咖啡酸适宜提取温度为60 ℃。

图 2 提取温度对咖啡酸提取量的影响

2.2.3 提取时间对奇亚籽咖啡酸提取量的影响如图3所示，在超声波和热效应的综合作用下可加快细胞壁的破裂，使得咖啡酸与溶剂充分接触，咖啡酸提取量在20～25 min提取时间范围内随着时间的延长而增加，在25 min时达到最高值；但长时间超声处理，随着响应的反转，空化效应的削弱或消失以及咖啡酸的氧化分解，使得咖啡酸提取量呈下降趋势。因此咖啡酸适宜提取时间为25 min。

2.2.4 料液比对奇亚籽咖啡酸提取量的影响

图 3 提取时间对咖啡酸提取量的影响

图 4 料液比对咖啡酸提取量的影响

如图4所示，料液比较小时，分子扩散速度慢，随着料液比的增加，分子扩散速度加快，咖啡酸提取量呈现增加趋势，并在1:20时达到最高。当达到传质平衡，即使溶剂用量继续增加，咖啡酸提取量也基本不变。考虑到实际生产过程中的成本问题，确定咖啡酸适宜提取料液比为1:20。

2.3 响应面优化

表 2 响应面分析试验方案与结果

在单因素试验的基础上采用Box-Behnken中心组合试验设计，对奇亚籽中咖啡酸提取工艺进行优化，Box-Behnken试验设计与结果见表2。以咖啡酸提取量为响应值，应用Design Expert软件进行多元回归拟合分析，得到回归模型参数和方差分析，结果如表3所示，得到多元二次回归方程：咖啡酸提取量=655.95-1.66+1.23+1.04+0.34-0.015+0.053+0.060-0.075-0.028+0.013-2.66²-2.76²-2.13²-2.91²。

表 3 回归方程各项的方差分析

注：*:<0.05,**:<0.01

由表3可知，回归模型的<0.0001，表明超声辅助乙醇法提取咖啡酸提取量与四个因素之间的回归方程极显著。模型失拟项>0.05，不显著，说明该单因素试验结果和数学模型模拟良好，可以利用该方程确定奇亚籽中咖啡酸的提取工艺。根据值和值可以看出，各因素对咖啡酸提取量的影响大小依次为：乙醇浓度>提取温度>提取时间>料液比。一次项及二次项的值均小于0.001，达到极为显著水平，表明这些因素对咖啡酸提取量的影响极大，且考察因素对响应值的影响不是简单的线性关系。根据回归方程，做出响应面图和等高线图，结果见图5。

通过软件Design-Expert7.0求解方程，得到咖啡酸提取的最佳工艺为：乙醇浓度82%、提取时间26 min、提取温度62 ℃、料液比1:20，此时咖啡酸提取量为656.475 mg∙g-1。

2.4 咖啡酸抗氧化性研究

2.4.1 奇亚籽咖啡酸对DPPH•清除率的影响由图6可知，随着质量浓度的变大，咖啡酸对DPPH•的清除率呈线性增加，且均高于对照品VC，当质量浓度达到0.25 mg∙mL-1时，咖啡酸的清除率为69.18%，而VC的清除率为49.24%。

图 6 咖啡酸对DPPH•清除率影响

2.4.2 奇亚籽咖啡酸对•OH清除率的影响

图 7 咖啡酸对羟基自由基清除率影响

由图7可知，咖啡酸对羟基自由基有较好的抑制作用，清除率随咖啡酸质量浓度的增大而升高，呈现良好的剂量-效应关系，清除能力高于对照品VC，当质量浓度达到0.25 mg∙mL-1时，咖啡酸的清除率为75.32%，而VC的清除率为64.26%，咖啡酸抗氧化能力更强。

3 结论

（1）经过单因素试验和响应面优化试验得到奇亚籽中咖啡酸的最佳提取工艺为乙醇浓度82%、提取时间26 min、提取温度62 ℃、料液比1:20，此时咖啡酸提取量为656.475 mg∙g-1；

（2）对在最优提取条件下获得的咖啡酸进行抗氧化性测定表明，咖啡酸对DPPH自由基和羟基自由基清除能力随着咖啡酸浓度的增加而提高，清除能力高于对照品VC，具有较强的抗氧化性。

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Caffeic Acid Extracted from Chia Seeds by the Response Surface Method Optimized with Ultrasonic-assisted and Its Antioxidant Activity

HOU Xiao-lin, XIANG Li-xuan, LI Ming-zhu*, FENG Jin-xiao

266300,

Caffeic acid is a natural antioxidant that is widely used in cosmetics and medicine. As a safe and effective natural product, caffeic acid has a variety of biological activities, and can also be used as a food additive in the food field in the future. Caffeic acid was extracted from Chia seeds by ultrasonic assisted ethanol method. The extraction process of caffeic acid was optimized by single factor test and response surface optimization test, and the antioxidant activity of caffeic acid was studied. The results showed that when the ethanol concentration was 82%, the extraction time was 26 min, the extraction temperature was 62℃ and the solid-liquid ratio was 1:20 (g∙mL-1), the extraction amount of caffeic acid from Chia seeds was 656.475 mg∙g-1. The scavenging ability of caffeic acid on DPPH radical and hydroxyl radical increased with the increase of the concentration of caffeic acid, and the scavenging ability was higher than that of the control substance VC. When the mass concentration reached 0.25 mg∙mL-1, the highest scavenging rates were 69.18% and 75.32%, respectively, indicating that caffeic acid had strong antioxidant ability.

Chia seed; caffeic acid; antioxidant activities

TS209

A

1000-2324(2022)06-0906-07

2022-02-12

2022-03-04

青岛工学院科研计划项目(2022KYJH002).

侯笑林(1983-),女,硕士研究生,研究方向:天然产物活性成分提取分离研究. E-mail:190834051@qq.com

Author for correspondence. E-mail:limingzhu@qit.edu.cn

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.06.015