应用网络药理学分析萝藦促进母猪泌乳的药效物质基础和靶点

李涪锌，白家成，曲雪嘉，王春花，2

(1.牡丹江师范学院生命科学与技术学院，黑龙江 牡丹江 157000 ； 2. 东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江 哈尔滨 150036)

母猪乳汁是新生仔猪营养物质需求的最理想来源，对仔猪的繁育意义重大，母猪产乳量多少直接影响新生仔猪的存活率和生长。规模化养殖场通过多种措施改善后，在排除饲养管理、环境因素以及母猪乳腺等疾病问题外[1]，母猪缺乳仍常有发生，特别是初产母猪和老龄母猪，如何有效提高母猪产乳量已成为养猪业关注的热点。中兽医认为，导致母猪缺乳的原因主要与营养不良、分娩过程致使母猪气血虚弱，以及喂养过度、运动缺乏等造成脂肪堵塞致使母猪气血瘀滞有关[2]，临床常在母猪生产前后饲料中添加补气、养血、理气活血、通经下乳类中药改善母猪缺乳症状[3]。萝藦(Metaplexisjaponica)又名奶浆草，为萝藦科萝摩属多年生草质缠绕藤本植物，亚洲地区均有分布，具有补气益精、行气止血、消肿解毒、通乳、止带之功效，可用于治疗体质虚弱、乳汁不足、遗精等[4]。《本草汇言》中记载“萝藦补血、生血，功过归、地；壮精培元，力堪枸杞；化毒解疔，与金银花、半枝莲、紫花地丁，共效验亦相等也”[5]，萝藦催乳作用可能与其补血、生血、化毒解疔之功效有关。中兽医古籍《猪经大全》也记载了萝藦治疗缺乳母猪的方法[6]，但其药效基础和机制未见报道。田间、沟边杂草萝藦价格低廉且催乳作用明确，具有开发为母猪催乳功能类饲料添加剂的价值。但目前萝藦的研究主要集中在药用成分分离和鉴定以及其抗癌、增强免疫作用方面，在催乳功效上的基础研究还属空白，因此明确萝藦对母猪泌乳性能药效物质基础与调控机制是萝藦开发的关键。本试验基于网络药理学技术虚拟筛选萝藦调控母猪泌乳的药效物质基础和靶点，为明确萝藦药效基础以及研究调控泌乳的作用机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 萝藦化合物-靶点网络的构建与分析 基于参考文献[7-10]获得萝藦化学成分，借助ChemBioDraw软件绘制化合物的分子结构式，并导入PharmMapper服务器，进行潜在靶点预测分析，打分值(z-score)>0.9的蛋白作为该化合物的重要靶点蛋白，通过Cytoscape 3.7.1软件构建萝藦化合物-靶点网络，分析化合物和靶点间的连接度(Degree)。

1.2 萝藦靶点PPI网络的构建与分析 在GeneCards数据库(https://www.genecards.org)以关键词“Lactation disorders”和“Hypogalactia”检索，设定推理分数(Inference score)、关联分数(Relevance score)>20筛选缺乳相关靶点。将萝藦重要靶点与缺乳相关靶点代入在线数据库STRING 11.0(https://string-db.org)，物种选择为“Susscrofa”，获取萝藦化合物靶点蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein interaction,PPI)网络信息，通过Cytoscape 3.7.1软件构建萝藦与缺乳靶点的PPI网络图，分析确定萝藦调控泌乳的核心靶点。

1.3 萝藦核心靶点GO和KEGG富集分析 将萝藦与缺乳直接相关的核心靶点(Degree≥40)上传数据库DAVID(https://david.ncifcrf.gov)，物种限定为“Susscrofa”，以P<0.05作为具有统计差异筛选条件，进行基因本体(Gene ontology,GO)生物学过程富集和京都基因与基因组百科全书(KEGG pathway analysis，KEGG)代谢通路富集分析，探讨萝藦促进母猪泌乳的分子机制。

1.4 萝藦核心靶点的归经分析 将关键靶点(Degree≥20)输入BIOGPS数据库(http://biogps.org/#goto= welcome)，物种限定“Pig”，搜索各靶点器官分布信息，通过Cytoscape 3.7.1软件绘制萝藦靶点-归经网络图。

2 结果

2.1 萝藦化合物-靶点网络的构建与分析 共收集到萝藦的化学成分64个，包括C21甾体(29个)、萜类(4个)、黄酮类(9个)、苯丙素类(5个)、生物碱类(4个)和其他类化合物(13个)。利用PharmMapper服务器绘制并搜索化合物靶点，去除无靶点化合物14个，共获得50个含有靶点的化合物作为萝藦活性化合物进行分析(表1)。化合物-靶点网络(图1)共包括457个节点(50个化合物，407个靶点)和1 564条边，其中，红色节点代表萝藦化合物，节点大小与Degree相关，圈内红色节点代表萝藦关键化合物(Degree>65)，蓝色节点代表靶点，该网络说明萝藦泌乳功效可能是多成分、多靶点作用的结果。在萝藦化合物-靶点网络中，每个化合物有平均靶点数目31.28个，每个靶点平均与8.14个化合物相互作用，芹菜素(Apigenin)、山奈酚(Kaempferol)、表儿茶素(Epicatechin)、异鼠李素(Isorhamnetin)和邻苯二甲酸二丁酯(DBP)等为萝藦重要化合物(Degree≥10)。从靶点角度来看，前列腺素合酶G/H-1(Prostaglandin G/H synthase 1)、孕激素受体(Progesterone receptor)、碳酸酐酶Ⅱ(Carbonic anhydrase 2)等为萝藦重要靶点(Degree≥10)。Degree≥60的萝藦化合物信息见表2，Degree≥20的萝藦靶点信息见表3。

表1 萝藦化合物Table 1 Metaplexis japonica compounds

图1 化合物-靶点网络图Fig.1 Compound-target network红色节点:萝藦化合物; 圈内红色节点:萝藦重要化合物; 蓝色节点:靶点; 节点大小与Degree相关Red node:Metaplexis japonica compounds; Red node in the circle: Important compounds of Metaplexis japonica； Blue node:Targets. Node size was related to Degree

表2 萝藦Degree≥60的核心化合物基本信息Table 2 Basic information for Degree≥60 core compounds in Metaplexis japonica

2.2 萝藦靶点PPI网络的构建与分析 为了更好地理解萝藦促进母猪泌乳的分子机制，利用STRING数据库分析萝藦重要靶点与缺乳相关靶点PPI关系，如图2所示，PPI网络共包括327个节点，直接与缺乳相关靶点连接的萝藦化合物靶点74个，为萝藦调控母猪泌乳的核心靶点。其中，TP53、ALB、TNF、IL-6、COMT、MAOA、POR、HTR2A、SLC6A4、SLC6A3、GPRIN1为化合物与猪缺乳共同靶点，在萝藦调控母猪泌乳性能中起到关键作用。

表3 萝藦Degree≥20的靶点基本信息Table 3 Basic information for Degree≥20 targets in Metaplexis japonica

图2 萝藦与母猪缺乳靶点PPI网络图Fig.2 PPI network of Metaplexis japonica and sow hypogalactia左侧圆形节点:萝藦靶点; 右侧圆形节点:母猪缺乳靶点; 中间圆形节点:化合物与母猪缺乳共同靶点; 节点大小、颜色深浅与Degree成正比Circle nodes on the left side:Targets of Metaplexis japonica； Circle nodes on the right side：Targets of sow hypogalactia; Middle circle nodes:Common targets of compounds and sow hypogalactia. The size and color depth of the node was proportional to Degree

2.3 萝藦核心靶点GO和KEGG富集分析 将萝藦与缺乳直接相关的核心靶点(Degree≥40)蛋白输入DAVID数据库，如图3所示，GO功能富集分析得到GO条目115个(P<0.05)，生物学过程(BP)条目84个，占73%；细胞组成(CC)条目10个，占9%；分子生物学功能(MF)相关条目21个，占18%。如图4所示，萝藦调控母猪泌乳的核心靶点KEGG通路富集得到106条有效信号通路，其中母猪泌乳性能相关的信号通路包括雌激素信号通路(Estrogen signaling pathway)、催乳素信号通路(Prolactin signaling pathway)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)等，为萝藦调控母猪泌乳性能重要信号通路网。

2.4 萝藦核心靶点的归经分析 利用BIOGPS数据库对关键靶点(Degree≥20)定位分析，共70个靶点，保留每个基因表达量最高的组织(心脏、血液、巨噬细胞、胸腺、胰腺、肾脏、肝脏、肠等)，利用Ctyoscape

图3 萝藦核心靶点GO富集分析Fig.3 GO analysis of Metaplexis japonica core targets

图4 萝藦核心靶点KEGG通路Fig.4 KEGG pathway analysis of Metaplexis japonica core targets

软件绘制靶点-归经网络图。如图5所示，将查找到的组织器官根据其所在系统进行分类，这些组织和器官主要分布在免疫系统(胸腺、脾、巨噬细胞、肠系膜淋巴结)、血液循环系统(血液、心脏、腹主动脉)、神经系统(脑)、消化系统(大肠、小肠、肝脏、胰腺)、生殖系统(子宫、胎盘)、运动系统(骨)、呼吸系统(肺、气管)、泌尿系统(肾脏、输尿管)。其中有24个靶点作用于免疫系统、20个靶点作用于消化系统、9个靶点作用于血液循环系统、7个靶点作用于泌尿系统。表明萝藦促进母猪泌乳作用的靶点多作用于免疫系统、消化系统和血液循环系统。

图5 萝藦靶点-器官定位网络Fig.5 Metaplexis japonica target-organ localization network深蓝色节点:生殖系统; 黄色节点:血液循环系统; 粉色节点:呼吸系统; 绿色节点:消化系统; 橘色节点:免疫系统; 棕色节点:神经系统; 紫色节点:泌尿系统; 红色节点:运动系统; 蓝色节点:关键靶点Dark blue node:Reproductive system; Yellow node:Blood circulation system; Pink node:Respiratory system; Green node:Digestive system; Orange node：Immune system; Brown node：Nervous system；Purple node：Urinary system； Red node:Exercise system； Blue node:Key target

3 讨论

在养殖生产中，母猪乳汁质量不仅是衡量哺乳母猪营养状况的重要指标，更关系到出生仔猪的健康状况。因此，有效防控母猪产后缺乳的发生可提高养殖业的经济效益和养殖者的积极性。在兽医临床中常用补气养血类中药，如当归、川芎、白芍、地黄、黄芪、阿胶等，兼以通乳类中药，如王不留行，治疗母猪产后乳量不足。研究显示，在妊娠母猪生产前后饲料中添加补气养血类中药可防控产后气血不足引起的母猪产后缺乳现象[11]。中药萝藦的催乳应用历史悠久，喂食鲜草可增加产后母猪乳量。萝藦具有一定研究与开发价值，通过网络药理学虚拟筛选萝藦调控母猪泌乳的物质基础和靶点，可为其在动物营养、中兽医领域应用和开发提供基础，为中兽药、中药饲料添加剂的研究拓展新思路。

3.1 萝藦促进母猪泌乳的药效物质基础分析 在进行潜在靶点预测分析时，文献多将打分值(z-score)降序排列后取z-score>0.5作为化合物的重要靶点蛋白[12]，本试验获得的相关靶点较多，故以z-score>0.9为参数，筛选萝藦化合物的重要靶点蛋白。经分析显示，萝藦含有C21甾体、萜类、黄酮类、木脂素类等化合物，其中芹菜素(Apigenin)、山奈酚(Kaempferol)、表儿茶素(Epicatechin)、异鼠李素(Isorhamnetin)和邻苯二甲酸二丁酯(DBP)等为萝藦重要化合物，在下乳通乳、补气补血、抗炎作用中起到不同程度的作用。芹菜素具有抗氧化和保护血管的作用，可通过调节体内胆固醇的代谢，促进胆固醇吸收、转化和逆向转运，降低血脂水平和加速血液循环，从而促进肥胖母猪产后乳汁分泌[13]。Zhong等研究发现，山奈酚具有抑制STAT3和IL-6表达的作用，为桔梗促进乳汁分泌的重要物质基础[14]。表儿茶素可通过抑制iNOS的合成减少NO的释放，从而发挥抗炎作用[15-16]。异鼠李素具有抗肿瘤、降血脂、降血压、抗炎症和抗氧化的作用[17]，可抑制炎症因子IL-1β和IL-6的分泌，降低iNOS活性和NO含量[18]，发挥抑制炎症反应作用，是维持乳腺健康和高效泌乳的有效成分。邻苯二甲酸二丁酯可提高泌乳中期母猪乳腺上皮细胞p-Akt和cyclin D1的表达，诱导PRLR、STAT5基因表达增多[19]，通过诱导催乳素与其受体结合，促进母猪乳腺上皮细胞泌乳。综上所述，萝藦主要通过多种化合物的多靶点、多作用通路共同实现治疗产后母猪乳汁分泌的目的，芹菜素、山奈酚、表儿茶素、异鼠李素和邻苯二甲酸二丁酯等是萝藦促进母猪泌乳的重要物质基础。

3.2 萝藦促进母猪泌乳的靶点分析 在GeneCards数据库以关键词“Lactation disorders”和“Hypogalactia”检索，获得直接与缺乳相关靶点连接的萝藦化合物靶点共327个，文献多以推理分数(Inference score)、关联分数(Relevance score)>20筛选缺乳相关靶点[20]，本试验为探讨其关键靶点，参考该域值进行筛选缺乳相关靶点，筛选后共获得74个直接与缺乳相关靶点连接的萝藦化合物靶点。本试验结果显示，TP53、ALB、TNF、IL-6、COMT、MAOA、POR、HTR2A等靶点为萝藦直接作用于母猪缺乳的关键靶点。TP53是萝藦与母猪产后缺乳疾病共同靶点，可以使癌细胞凋亡，发挥抗癌作用，同时可以调节机体正常的生命活动[21]。ALB 是血液循环中的主要循环蛋白，转运多种内源性和外源性化合物，还是一种多功能的蛋白质载体，多用于药物靶向[22]。TNF具有抗肿瘤、抗病毒、激活免疫细胞，诱发炎症反应作用，在机体自稳、防御反应中起到重要作用。TNF还是一个重要的内源性致热原，是不同病因所致发热机制中的一个共同环节[23]。IL-6促炎症细胞因子可视为研究缺乳的定性指标[24]，缺乳发生时血清IL-6会明显升高，通过抑制IL-6可以促进乳腺炎症的改善和乳汁分泌的增加。COMT具有基因多态性，可显示不同的活性，因而决定不同的儿茶酚雌酮的分解速度，可将儿茶酚雌酮甲基化为可溶于水的代谢产物排出体外，在与雌激素刺激有关的乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌等妇科肿瘤的发病过程中起到重要的作用[25-26]。MAOA抑制剂Clorgyline可定向改变乳腺癌细胞的生长、迁徙、侵袭[27]。POR为机体内质网膜上对多种内源、外源物质的代谢至关重要的一种酶[28]，可参与和调控胆固醇、性激素和毒素等内源和外源物质的代谢[29]。HTR2A(5-羟色胺2A受体)可以调节5-羟色胺(5-HT)，5-HT是参与调节胃肠道运动和分泌功能的重要神经递质，可以调节情绪、食欲、睡眠等，并能调节血液循环，因此在母猪饮食中添加含HTR2A的药物，可预防其因气血瘀滞或肝郁气滞等原因导致的产后缺乳[30]。此外，5-HT可以使乳腺组织呈高度泌乳状态，具有促进乳汁分泌的作用[31]。这些核心靶点主要富集在多种激素调节、能量代谢和细胞增殖等通路网，包括雌激素信号通路(Estrogen signaling pathway)、催乳素信号通路(Prolactin signaling pathway)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)等。催乳素信号通路是哺乳中最重要的通路，可以由催乳素激活，其最具代表性的作用是能够诱导细胞上皮生长和刺激产后乳汁分泌。综上所述，萝藦可通过TP53、ALB、TNF、IL-6、COMT、MAOA、POR、HTR2A等多靶点调节母猪能量与营养代谢、激素水平、情绪状态等，其促进泌乳的作用机制可能与调控催乳素信号通路和雌激素信号通路有关。

综上所述，萝藦主要通过芹菜素、山奈酚、表儿茶素、异鼠李素作用TP53、ALB、TNF、IL-6、COMT、MAOA、POR、HTR2A等靶点调节免疫、改善血液循环促进产后母猪泌乳。