仔猪细菌性腹泻病原菌的分离鉴定与耐药性分析

吴 杨，闫艳新，孙虎芝，潘 强，2，任慧英，，张 灿

(1. 青岛诺安百特生物技术有限公司，山东 青岛 266000 ； 2. 青岛特种食品研究院，山东 青岛 266109 ；3. 青岛农业大学动物医学院，山东 青岛 266109)

仔猪腹泻病是一种多发于断奶期或哺乳期仔猪的消化系统疾病，是引起仔猪死亡的重要原因之一，严重影响了生猪养殖的正常进行，常常给养殖场造成巨大的经济损失。引起仔猪腹泻的原因主要分为2种：传染性因素和非传染性因素。非传染性因素包括养殖环境、饲料条件等导致仔猪缺乏营养或者引起仔猪发生应激反应的因素；传染性因素包括细菌性腹泻和病毒性腹泻2种，细菌性腹泻包括大肠杆菌引起的黄白痢、沙门菌引起的仔猪副伤寒、产气荚膜梭菌引起的红痢、猪痢疾密螺旋体引起的猪痢疾等[1]，引起病毒性腹泻的病原包括伪狂犬病毒、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒等。近年来，细菌感染引起仔猪腹泻成为危害生猪养殖的一大问题，同时，由于抗菌药的滥用，多重耐药菌株的出现导致仔猪腹泻的治疗愈发困难。本试验收集大量腹泻仔猪的肝脏或肠道内容物样品，对其病原菌进行分析，旨在为细菌性仔猪腹泻的预防和治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源 2019年1月—2020年5月收集了来自潍坊、烟台和青岛地区具有一定规模的养猪场患有腹泻的仔猪的肝脏或肠道内容物样品共计1 014份，其中肝脏53份，肠道内容物961份。

1.2 主要试剂材料 SS琼脂、蛋白胨、牛肉浸粉、琼脂粉、脱纤维绵羊血、MH琼脂、胰蛋白胨大豆琼脂、胰蛋白胨大豆肉汤，均购自青岛海博生物有限公司；2 ×TaqMaster Mix (Dye Plus)、DL 2 000 Plus DNA Marker，均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司；特异性引物由北京华大基因科技有限公司合成。

1.3 病原菌分离鉴定 无菌取肝脏样品于SS琼脂平板划线，37 ℃培养18 h；取肠道内容物于血琼脂平板划线，置于37 ℃厌氧培养18 h。根据平板上菌落形态进一步鉴定不同的细菌，挑取SS平板中红色且有玫红色突起的菌落鉴定大肠杆菌，挑取透明或半透明菌落鉴定沙门菌；挑取血琼脂平板上有双层溶血环的菌落鉴定产气荚膜梭菌。

1.4 细菌特异性PCR鉴定 煮沸法提取DNA后，用特异性引物进行分离菌株的PCR鉴定，引物序列、扩增片段长度及退火温度见表1。25 μL PCR反应体系：2×TaqMaster Mix(Dye Plus)12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min；退火温度根据引物不同可作更改。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪成像观察条带。

表1 细菌特异性鉴别引物Table 1 Bacteria specific differential primers

1.5 大肠杆菌常见毒力基因鉴定 将临床分离的大肠杆菌进行9种常见毒力基因[2]的PCR鉴定，引物序列、扩增片段长度及退火温度见表2。PCR反应体系及反应条件同1.4，退火温度根据引物不同可作更改。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪成像观察条带。

表2 9种大肠杆菌常见毒力基因引物Table 2 9 common virulence gene primers of E.coli

续表

1.6 致病性大肠杆菌药物敏感性试验 根据欧洲抗菌药敏感性试验委员会(European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing,EUCAST)标准，使用纸片扩散法测定致病性大肠杆菌的药物敏感性[3]。将菌悬液浊度调整至0.5麦氏浊度，接种于MH琼脂培养基，15 min内将10种常用药物药敏纸片放置于培养基表面，35 ℃恒温培养18 h后测量抑菌圈直径，判断细菌的药物敏感性。

2 结果

2.1 病原菌分离鉴定 从987份样品中分离到大肠杆菌，分离率为97.34%(987/1 014)；35份样品中分离到沙门菌，分离率为3.45%(35/1 014)；4份样品中分离出产气荚膜梭菌，分离率为0.39%(4/1 014)。表明在山东的养殖场中，引起细菌性仔猪腹泻的病原菌主要是大肠杆菌。

2.2 大肠杆菌常见毒力基因鉴定 对分离出的987株大肠杆菌进行9种常见毒力基因的鉴定。共检测出169株大肠杆菌含有毒力基因，毒力基因的携带率为17.12%。致病性大肠杆菌中黏附素的主要类型为K88(47.34%)和F18ac(31.95%)，毒素类型主要为LT1(48.52%)和ST2(31.36%)，见表3。

表3 9种毒力基因型大肠杆菌分离率Table 3 Isolation rates of 9 virulence genotypes of E. coli

2.3 致病性大肠杆菌药物敏感性试验 对987株大肠杆菌中鉴定出携带毒力基因的169株大肠杆菌，进行10种常用药物的药敏试验，结果如表4和图1～2所示，169株大肠杆菌对10种常用药物均有不同程度的耐药性，耐药率均达到60%以上，并且出现多重耐药现象，超过80%的菌株具有7重及以上的耐药性，有35株大肠杆菌对10种抗生素均耐药。

表4 169株大肠杆菌分离株的耐药率Table 4 Drug resistance rates of 169 E.coli isolates

图1 大肠杆菌分离株的药物敏感性Fig.1 Drug sensitivity of E.coli isolates

图2 169株大肠杆菌多重耐药情况Fig.2 Multiple drug resistance of 169 E.coli isolates

3 讨论

近年来，由于生猪养殖规模的不断扩大，仔猪腹泻时有发生，且在危害生猪养殖的疾病中处于首位。引起仔猪腹泻的原因较为复杂，细菌性、病毒性以及病毒和细菌混合感染都是导致仔猪腹泻的主要原因，并且细菌感染引起的仔猪腹泻发病率处于逐年上升的态势，本试验调查山东各地区引起仔猪腹泻的流行菌株并分析其耐药性，可以为生猪养殖提供一定的指导，防止造成更大的经济损失。

本试验采集的1 014份仔猪腹泻样品中分离到了1 026株病原菌，其中大肠杆菌检出率最高(97.34%)，同时还分离到了沙门菌(3.45%)和产气荚膜梭菌(0.39%)，检出率相对较低。李珍珍[1]报道的兰州地区仔猪腹泻样品病原菌分离结果以大肠杆菌(93.33%)和产气荚膜梭菌(90%)为主，说明山东地区与兰州地区仔猪腹泻病的发病因素不同，山东地区以大肠杆菌引起的仔猪黄白痢为主，而兰州地区以产气荚膜梭菌和大肠杆菌混合感染引起的仔猪红痢为主。大肠杆菌、沙门菌和产气荚膜梭菌均为常见肠道菌群[4]，仅在养殖条件发生恶化导致仔猪肠道菌群失衡，免疫下降时引起腹泻。

大肠杆菌肠毒素以及志贺毒素在各地区流行株中存在一定的差异性。本试验发现在青岛、烟台和潍坊等山东地区以LT1和ST2为主要的毒素类型。陈祥等[5]报道在华东部分地区毒素基因以ST1和ST2为主；石大丽[6]报道了广西部分地区大肠杆菌毒素基因主要为ST2；王春江等[7]的研究表明在陕西地区大肠杆菌毒素基因的主要类型是ST1；杨宇[8]报道了浙江等地区大肠杆菌主要毒素基因是ST1。表明肠毒素基因在各地区的流行存在地域差异性。同时，本试验中分离到的含有毒力基因的大肠杆菌分离株普遍含有肠毒素基因，产肠毒素性大肠杆菌是致病性大肠杆菌中最主要的类型[9]，具有极高的危害性。产肠毒素性大肠杆菌可定植在仔猪的空肠和回肠中，在繁殖过程中不断分泌肠毒素，进而引起仔猪腹泻，甚至导致仔猪死亡，给养殖业造成巨大的经济损失，因此对产肠毒素性大肠杆菌进行控制是目前亟需关注的问题。

本试验发现在青岛、烟台和潍坊等山东地区，大肠杆菌黏附素基因以K88为主；沈丽萍等[10]报道了上海地区主要大肠杆菌黏附素为K99；唐树霄[11]报道了江苏地区大肠杆菌主要黏附素为K88、K99、F41；石大丽[6]报道的广西地区主要的大肠杆菌黏附素为K88和K99；王春江等[7]报道的陕西地区大肠杆菌主要黏附素为K99。表明近年来大肠杆菌黏附素在各地区流行具有多样性。本试验中大肠杆菌分离株的K99检出率相对其他地区较低，但不同的黏附素类型均能导致仔猪腹泻的发生。K99黏附素可以附着在仔猪肠道黏膜表面，K99的表达常常受到环境因素的影响，例如透气程度、细胞的生长速率等[12]；F41黏附素在O9和O8型大肠杆菌中常常与K99黏附素结合在一起，它的表达也受多种因素影响，但目前位置对F41鞭毛结构等的研究还不明确[13]；K88黏附素是肠毒素性大肠杆菌最常见的黏附素类型，主要分为ac、ab和ad三个类型[14]，K88ac是3种K88黏附素中最常被检测到的，K88和987P黏附素受体均位于小肠的上皮细胞中，K88的受体多为脂多糖，987P的受体一般是糖蛋白或糖脂[15]。

选择10种常用药物进行药敏试验发现，169株致病性大肠杆菌均为多重耐药菌株，且有80%以上的菌株为7重及以上耐药菌株，对所有药物耐药率均在60%以上，说明山东地区养殖场抗菌药耐药严重，与国内其他地区耐药情况有所不同[16-17]，说明我国不同地区养殖场的用药类型不同。与往年山东地区相关报道相比，本试验结果显示致病性大肠杆菌的耐药率有所上升[18]，说明抗菌药使用情况未得到改善。滥用抗菌药治疗会增加细菌的耐药性，合理用药及寻求新的细菌性疾病解决方案势在必行。