梅花针联合超声导入在增生性瘢痕兔耳模型光动力治疗中的应用研究

张明莉，柯锦城，焦云鹤，马 莉

（厦门医学院附属第二医院，福建 厦门，361021）

增生性瘢痕是一种由创伤、手术、烧伤、痤疮和带状疱疹等恢复不当引起的病理性瘢痕[1]，对患者的形体美观、肢体功能以及心理健康均产生严重影响。目前病理性瘢痕仍缺乏非常理想的治疗手段，近年来有研究应用光动力疗法对病理性瘢痕或其成纤维细胞进行治疗，取得了一定的疗效，但由于光敏剂前体药物和光的穿透深度有限，治疗效果仍欠理想，需要改善前体药物给药方法和光的传入途径，以加强瘢痕组织对光动力的治疗反应[2]。本研究使用动物模型，拟观察采用梅花针联合超声波导入光敏剂的光动力治疗方法对增生性瘢痕的有效性和安全性。

1 材料和方法

1.1 实验材料与仪器

新西兰大耳白兔6只，均为雄性，体重2.0～2.5 kg，购自上海市松江区松联实验动物场。TUNEL试剂盒购自瑞士Roche公司；Masson染色试剂套装购自厦门安提海拉生物科技有限公司；光敏剂外用盐酸氨酮戊酸散购自上海复旦张江生物医药有限公司；LED光谱治疗仪购自科诺医学仪器设备有限公司；超声波导入仪器购自以色列飞顿公司。

1.2 实验方法

1.2.1 兔耳增生性瘢痕(HS)模型建立

本研究经伦理委员会审批，参考贾宇博等造模方法[3-4]，6只新西兰大耳白兔，5%异氟烷气麻生效后将浓度降低为3%维持麻醉，剃刀刮除兔耳腹侧毛发，露出光滑皮肤，充分暴露操作视野，展平兔耳，避开皮下较大血管，沿兔耳腹侧长轴用环钻做直径8 mm创面，切除全层皮肤，保留软骨，11号手术刀片以及止血钳将软骨膜刮除剔除干净，后纱布压迫止血3-5分钟，待创面自行愈合，愈合前创面未给予碘伏消毒等任何操作。33周后创面上皮化，形成突出于皮肤表面的红色增生性瘢痕，界限清晰，表面光滑无毛。6只大耳兔每耳造模6～7个，间隔1～1.5cm，共建立60个可供实验用的瘢痕组织。

1.2.2 实验分组与方法

造模成功后将60个增生性瘢痕随机分成3组（实验组、对照组、空白组），每组20个。实验组HS先经过梅花针点刺，压迫止血，外涂20%盐酸氨酮戊酸凝胶制剂（ALA），超声波导入（50HZ,占空比50%）2.5 min后外敷3 h，LED红光源(633 nm)照射30 min，能量密度100 mW/cm2，连续3次，每次间隔1周。对照组HS单纯进行光动力治疗，20%ALA凝胶制剂外敷3 h后照光30 min，能量密度100 mW/cm2，连续3次，间隔1周。空白组未经任何处理。光动力治疗结束后4周，观察瘢痕组织大体形态变化，切取各组HS组织进行Masson染色观察胶原变化，此外使用TUNEL（免疫组化法，具体按照TUNEL试剂盒说明书进行操作）检测细胞凋亡。

1.2 观察指标与疗效判定标准

TUNEL免疫组化结果判定采用采阳性系数的判定方法[5]，阳性系数记分=染色强度记分×阳性细胞百分比记分。棕黄色、棕褐色为阳性染色，阳性细胞百分比=染色阳性的细胞个数/细胞总数×100%，＜5%记0分，6%～25%记1分，26%～50%记2分，＞51%记3分。显微镜下随机选择3个高倍视野（400×），依据染色强度进行评分，不染色记0分，淡染色记1分，中等强度染色记2分，深染色记3分。阳性系数判断标准：阴性(-)为0～1分；弱阳性()为2～3分，中等阳性()为4～6分，强阳性()为9分。疗效判定标准：阳性系数0～1分无效，2～3分为显效，4分以上为优效。

1.3 统计学分析

采用SPSS 23.0统计软件，等级资料采用非参数秩和检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组瘢痕组织外观形态变化

治疗前HS组织色红、隆起、质硬韧；治疗后，实验组HS色泽明显变淡、质地明显变平变软，空白组瘢痕组织色略暗淡、质地变化不明显，对照组变化介于两者之间，见图1。

图1 治疗前后瘢痕组织外观形态变化

2.2 各组瘢痕组织胶原纤维Masson 染色

胶原纤维呈蓝色。空白组真皮胶原纤维粗大紊乱，排列紧密；实验组胶原变细、排列规则疏松；对照组胶原粗细、排列密度及规则度方面的改善均较实验组为弱、较空白组明显，见图2。

图2 治疗后瘢痕组织胶原纤维Masson 染色

2.3 TUNEL 结果

3组TUNEL检测细胞凋亡情况见表1和图3，各组染色结果阳性系数等级分布见表2，各组疗效比较见图4。经非参数秩和检验，实验组与对照组以及实验组与空白组有效率两两比较，Z值分别为-2.190和-3.543（P＜0.05）。

表1 三组阳性细胞百分比均值（，%）

表1 三组阳性细胞百分比均值（，%）

图3 TUNEL 检测细胞凋亡情况

表2 三组阳性系数等级分布

图4 各组疗效情况

3 讨论

光动力（PDT）治疗病理性瘢痕，是近年来研究较多的新方法。现有研究发现PDT疗法通过上调基因p53/p21、Bax/Bcl-2的比值以及caspase-3剪切等机制导致成纤维细胞凋亡[6]，同时PDT明显限制成纤维细胞TGF-β1及碱性成纤维细胞生长因子mRNA的表达[6,7]，减少血管形成[8]，抑制细胞增殖，促进成纤维细胞凋亡，进而使血流减少、柔韧性增加、胶原蛋白和血红蛋白水平下降[9]。由于光敏剂前体药物吸收有限等因素制约，PDT在瘢痕方面的治疗效果仍有待提升。

梅花针是我国传统医学当中重要外治法之一，现代医学中属于物理治疗范畴[10]。梅花针叩刺可人为造成众多微小孔道，有利于外用药物渗透吸收[11]。有研究采用梅花针垂直叩刺皮肤癌皮疹预处理后进行10%盐酸氨酮戊酸（ALA）凝胶封包，可提高ALA的药物渗透，加强了ALA-PDT 治疗皮肤肿瘤的疗效[12,13]。

超声波技术是现代医学常用技术手段之一，除了作为常规检查技术，还可以用于疾病的治疗。当一定强度和频率的超声能量作用于液体时会产生众多微小气泡，这些微泡会发生震荡、膨胀甚至爆裂，这称之为超声波的空化效应。当空化效应发生在细胞膜表面时，细胞膜形成瞬时可逆的断裂、塌陷，形成声孔效应，从而增加细胞膜通透性，有利于药物转运到细胞内[14]。发生空化效应时，声场能量瞬间释放，细胞微环境可以产生高温高压，产生活性氧物质、细胞降解坏死等一系列继发损伤。同时Prescott[15]等发现超声波空化效应可以通过破坏细胞骨架而直接使细胞损伤死亡。

本研究将梅花针与超声波导入联合使用，研究结果显示，实验组（梅花针联合超声波导入处理后再进行光动力治疗组）的瘢痕组织色泽更淡，质地较对照组

（单独光动力治疗组）和空白组（未给予任何处理）更平软，且胶原变细、排列更规则疏松；实验组细胞凋亡水平亦高于其他两组。从研究结果看，光动力治疗前经过梅花针点刺联合超声波导入光敏剂前体药物的方法对增生性瘢痕治疗有效，且较单纯光动力治疗效果佳，可能与梅花针点刺打开组织通道后超声波加强促进了光敏剂前体药物的渗透转运吸收有关，光敏剂前体药物吸收增加可能使后续产生的单线态氧或氧自由基等活性氧物质增加，进而加强细胞毒性等光化学反应作用，增强光动力治疗效果。其次，超声波的空化效应可以使组织细胞骨架受损，促进细胞崩解，增加活性氧物质的产生，加速细胞伤亡，也可能协同强化了光动力的治疗作用。这提示梅花针点刺联合超声波导入促渗的方法可有效增强增生性瘢痕的光动力治疗效果。近年有研究表明，光敏剂ALA的代谢产物原卟啉(PpIX)也是一种较强的声敏剂，在适当频率和强度的超声波作用下产生声-化学效应，造成组织细胞损伤死亡，故本研究中若在ALA凝胶外敷结束充分产生PpIX时再次给予超声波作用，联合光照依次进行，笔者认为这是再次增强光动力治疗效果可以考虑尝试的方法。同时，本研究为动物实验研究，样本量偏小，操作过程中存在不可避免的实验误差，使得实验结果可能存在一定偏差。由于经费等问题，本研究中未能比较不同组别间光动力治疗后不同时段细胞凋亡水平的差异，未能探究梅花针和超声波单独预处理对光动力疗效的影响；由于实验条件等限制，本研究亦未能直接检测梅花针联合超声波导入处理后光敏剂前体药物的真实吸收水平、所产生的活性氧物质的具体含量，使得本研究存在一定的局限性，有待后续研究完善。