阳离子脂质体在基因治疗中的研究进展

汪琼卉,刘哲鹏，李北雪

上海理工大学 健康科学与工程学院（上海，200093）

0 引言

过去的三十年里，基因治疗作为一种具有潜力的治疗方法已经获得了极大的关注。它不仅可以用于治疗遗传性疾病，而且可以用于治疗和预防各种获得性疾病如癌症、囊性纤维化、艾滋病等［1］。在基因治疗中，不同类型的反义寡核苷酸进入细胞主要依靠内吞机制，但带高负电荷的主链极大地限制了它们与细胞的相互作用和靶向细胞的转染［2］。目前，用非病毒载体递送核酸分子已成为基因治疗的公认策略。其中，阳离子脂质体因其制备简单、具有可重复性以及生物可降解性等优点，已被广泛应用于临床诊断和基因治疗［3］。

1 阳离子脂质体组成成分

阳离子脂质体主要由阳离子类脂组成。类脂不仅可以单独组成脂质体，也可以和其他辅助类脂一起构成脂质体。常用的阳离子类脂由三部分组成，包括亲水头基、疏水尾基以及两者之间的连接键［3］。

1.1 亲水头基

带正电的亲水头基负责脂质体与核苷酸、细胞膜或细胞其他成分之间的相互作用，对基因传递起着至关重要的作用。不同类型的头基可分为：季铵、胺、氨基酸或多肽、胍、杂环头基和一些特殊的头基。

近年来，阳离子脂质体研究的另一个发展趋势是将一些基团如甘露糖、半乳糖或荧光基团结合到阳离子脂质的头基结构域中，从而提高体外和体内的转染效率。除此之外，一些与生物体内某些分子结构相似的阳离子脂质( 如心磷脂和磷酰胺衍生物等) 具有较低的细胞毒性和较高的转染效率，这为阳离子脂质体适用于人类基因治疗的发展提供了一个乐观的前景［4］。

1.2 疏水尾基

疏水尾基主要分为两类，分别是胆固醇环衍生物和脂肪酰链衍生物。辅助脂质一般为中性脂质，主要包括DOPE(1，2- 二油酸甘油- 3- 磷脂酰乙醇胺)、PC(1，2- 二酰基甘油- 磷脂酰胆碱)、DOPC(1，2- 二油酸甘油-3- 磷脂酰胆碱)、DPPC(1，2- 二 棕 榈 酸 甘 油- 3- 磷 脂 酰 胆 碱)、Chol( 胆固醇) 等。它们能够稳定脂质双层膜和降低阳离子脂质毒性［5］。

1.3 连接键

头基和尾基的连接键是阳离子脂质的化学稳定性和生物降解性的重要决定因素，并进一步控制其转染效率和细胞毒性。根据连接键的结构，它们可以分为许多类型，如醚类、酯类、酰胺类、二硫化类、尿素类、酰基腙类、磷酸盐类及其他特殊类型。醚类是最早使用的连接键，一般情况下带醚类连接键的阳离子脂质体可以获得较高的转染效率，但醚类连接键具有化学稳定性和不可生物降解性，从而导致较高的细胞毒性。与醚类连接键相比，具有生物可降解性的酯类掺入阳离子脂类可以增强细胞内的代谢或清除脂质，从而避免非天然脂质在细胞内长期存在并产生的不良后果。

研究者在进行设计时，应充分考虑连接键的长度、类型、位置等因素，这对合理设计高转染效率、低细胞毒性的新型阳离子脂质具有重要意义［6］。

2 制备方法

传统的阳离子脂质体制备方法有薄膜分散法、挤出法、逆相蒸发法、钙融合法和冻融法等。但这些方法在制备过程中存在有机溶剂或表面活性剂的残留，会对阳离子脂质体产生影响，而且不易控制粒径以及均匀化程度，从而使得这些技术很难应用的大规模制备阳离子脂质体中。

目前，新型制备方法包括改进的乙醇注入法、薄膜-冻融法、高压均质法、二氧化碳超临界法、真空干燥- 超声法、薄膜- 挤出法、薄膜- 冻干法和微流控技术等［7］。它们均有各自的优点，如采用高压均质法可使脂质体均匀化、微粒化，并且能更简化地制备出不同粒径的脂质体，适用于工业化生产。二氧化碳超临界法以二氧化碳为溶剂，具有环保、无毒和安全性。薄膜-挤出法可制备出粒径较小且均匀的单层阳离子脂质体。真空干燥超声法可在制备过程中除去有机溶剂等［8］。

此外，制备方法会影响阳离子脂质体在体内的转染效率和细胞毒性。Luca 等［9］分别通过自组装和微流控技术用DC-Chol 和DOPE 制备载pDNA的阳离子脂质体，结果发现自组装的阳离子脂质体内部呈多层体系，在结构上比微流控制备所得的脂复合物更稳定，使其在溶酶体中的降解效率变低，从而转染效率更高，而且自组装生成的脂复合物数量更少，不易在细胞内残留造成细胞毒性。而微流控技术制备的阳离子脂质体内部呈单层体系，生成的脂复合物较多，易在细胞内残留造成细胞毒性。

3 转染机制

作为一种基因载体，阳离子脂质体与携带负电荷的目的基因序列通过静电作用相互吸引结合，其转染过程主要是通过膜融合或细胞内吞作用进入细胞内，脂质复合物在细胞质中或进一步进入核内释放基因，从而完成细胞内的转录和翻译［10］。

除了受阳离子脂质的结构以及被测量的生物反应类型的影响，阳离子脂质体的转染效率也可能受被递送的基因的影响。如质粒DNA（pDNA）比线性DNA 更有效地传递到细胞中，因为pDNA与线性DNA 相比会产生更低的有效负电荷，因此需要更低量的阳离子脂质。

4 阳离子脂质体在不同核酸递送中的应用

由于基因治疗中包括pDNA、mRNA、siRNA、microRNA 和其他类型的反义寡核苷酸进入细胞主要通过内吞机制，但它们带高负电荷的主链极大地限制了它们与细胞的相互作用和靶向细胞的转染，所以通过阳离子脂质体将其运输到细胞核或胞质溶胶可达到治疗目的。

4.1 载pDNA 的阳离子脂质体

pDNA 作为生物药剂的研究备受关注，因其安全稳定、对多种外源基因的容纳量大、易生产而且不会直接引起人体免疫系统产生不良反应等优点，故可将其作为基因治疗的载体［11］。但其传递过程也面临一些挑战，如实现高负载能力和避免因pDNA 的高负电荷和高分子量而聚集。更重要的是，与mRNA 不同，pDNA 需要到达细胞核而不仅仅是到达细胞质来进行蛋白质翻译。

在阳离子脂质体制备中选择具有生物相容性的氨基酸作为脂质材料是常用的方法，且选择含有DOPE 的阳离子脂质体可以改善pDNA 在体内的转运。María 等［12］在研究中，将一种赖氨酸衍生物连接到C12 链上组成的阳离子脂质（LYCl）与辅助脂质（DOPE）结合制备而成的阳离子脂质体，可作为一种潜在的载体将两种pDNA（编码绿色荧光蛋白GFP 和荧光素酶）转染到COS-7 细胞。结果表明，LYCl/DOPE 阳离子脂质体平均粒径为200 nm 左右，且形成的多分散指数低的溶致液晶相有效压缩了pDNA，并防止DNA 酶使其降解，从而促进了细胞摄取过程。此结果证实了LYCl/DOPE 脂质双层是稳定的，并且能够稳定DNA片段。María 等研究出的最佳配方（LYCl 含量为20%）能够有效地完成转染过程，且细胞存活率高。

4.2 载mRNA 的阳离子脂质体

信使RNA(mRNA) 是基因的天然产物，在细胞内的主要任务是携带遗传信息并作为蛋白质合成的直接模板。目前，关于mRNA 的临床工作主要集中在疫苗接种、蛋白质替代疗法和遗传疾病的治疗上［13］。然而，由于需要改进其递送方式，mRNA 的应用仍然受到限制。

Zhang 等［14］用DOTAP: Chol（1:1）制备阳离子脂质体(CLPP/ mSur-T34A)，用于在体外和体内C26 结肠癌模型中递送编码survivinT34A 的mRNA。结果显示，制备的CLPP/mSur-T34A 平均粒径为（186.1±3.1）nm，且通过内吞作用在C26 肿瘤细胞上表现出较高的转染效率。CLPP/mSur-T34A mRNA 的表达对C26 结肠癌模型在体内外均有明显的治疗作用，并进一步表明CLPP/mSur-T34A mRNA 的表达是结肠癌治疗的潜在候选基因。

4.3 载siRNA 的阳离子脂质体

siRNA 即小干扰RNA，它能够抑制引起病毒感染和癌症的特定基因，具有作为治疗工具的潜力。与pDNA 相比，siRNA 分子量更低，仅由20～30 个碱基对组成，且不需要输送到细胞核发挥作用。而且siRNA 比microRNA 更具特异性。然而，siRNA 在应用中仍然存在许多挑战，包括脱靶效应、给药困难、免疫反应和细胞毒性等［13］。

近年来，关于阳离子脂质体传递siRNA 的研究集中在赋形剂和表面性质对其在细胞内传递效率的影响。阳离子脂质如（2,3-二油酰基-丙基）-三甲基铵- 氯盐（DOTAP）、1,2- 二油酰基-3-二甲基铵 - 丙烷（DODAP）、1,2- 二油醇-3 －二甲基氨基- 丙烷（DODMA）、1,2- 双十八烯氧基-3- 甲基铵丙烷（DOTMA）与DOPE/ 胆固醇/PEG 等以不同的摩尔比组成的阳离子脂质体常用于siRNA 的传递。另一种常用的配方是DCChol 和DOPE 以1:1 的摩尔比合成［2］。目前，多种基于siRNA 药物制剂的阳离子脂质体正在进行临床试验，其中应用最广泛的是稳定的核酸颗粒（SNALPs），其组分包括阳离子脂类、融合脂类、胆固醇和聚乙二醇（PEG）［16］。

虽然带正电的阳离子脂质体有利于跨膜转运，但也会与血液中的蛋白质相互作用，因此，当接触到血清时，阳离子脂质体会迅速从循环系统中被清除并立即释放siRNA。此外，阳离子脂类具有细胞毒性，如破坏细胞膜以及产生活性氧［17］。为了提高siRNA 的转染效率和降低细胞毒性，除了选择载体的组成成分之外，在阳离子脂质体上附加材料以提高稳定性也是一种广泛应用的策略，常用的附加材料包括聚乙二醇（PEG）、透明质酸（HA）、亲水性肽等［18］。

4.4 载microRNA 的阳离子脂质体

microRNA (miR) 在动植物中主要参与转录后基因的表达调控。通过合成阳离子脂质体递送miR，可抑制mRNA 的翻译，并调节其他功能基因，从而表现出其治疗潜力。

研究发现，血管内皮生长因子（VEGF-A）与甲状腺癌的转移或复发相关，且VEGF-A 是控制肿瘤血管生成的重要因素之一［16］。Maroof 等［19］制备了 DOTAP/Chol/DOPE 脂质体，通过静脉注射向甲状腺癌部位递送了miR-34b-5p，结果发现在体内和体外均抑制VEGF-A 的表达。

徐枫等［20］研究了靶向阳离子脂质体（CLPs）递送miR 对三阴性乳腺癌(TNBC) 相关特异性抑瘤基因的作用。通过薄膜分散法制备CLPs 并对其进行表面HA 靶向修饰，制备了新型透明质酸（HA）CLP。经过共聚焦检测和流式细胞术荧光检测, 验证了HA-CLPs 能够顺利将miR-205 运送至细胞内而且分布在细胞核附近, 证明了HA-CLPs 对TNBC 细胞具有较强的靶向特异性,且对TNBC 细胞的增殖和迁移起到了一定的抑制作用。

5 影响阳离子脂质体递送的因素

由于阳离子脂质体受理化性质和人体生理环境的影响，在基因治疗的临床应用中仍存在着阻碍。

5.1 生理环境

人体内环境相对复杂，比如细胞外屏障中调理素作用、网状内皮系统的快速清除作用以及肿瘤穿透性差，细胞内屏障包括内体/溶酶体的运输网络和核内扩散受限，阻碍负载外源基因的阳离子脂质体到达靶向部位。通过改变脂质材料和增加表面修饰如PEG 修饰剂可改变阳离子脂质体的特性，从而实现核酸的有效递送并达到治疗效果［19］。

5.2 理化性质

阳离子脂质体在体内分布情况不仅受生理环境的影响，还受其理化性质的影响，而理化性质主要由脂质组成决定。其中，阳离子脂质的分子结构和中性辅助脂质融合的能力对调控转染效率非常重要。同时，转染效率与阳离子脂质体的粒径和表面电荷相关，而这两者都受脂质组成的影响［20］。

6 展望

阳离子脂质体因其良好的靶向性、生物相容性以及能够大规模生产等优点，是目前研究最多的非病毒载体。其正电荷虽有利于与体内细胞融合，但也不可避免地增加了体内的免疫原性和毒性［21］。因此，关于阳离子脂质体在基因治疗方面的临床应用需要研究者关注阳离子脂质体在基因传递中存在的屏障及其理化性质对治疗结果的影响，从而保证高转染效率，并获得良好的药效学和药代动力学特性以满足临床需要。阳离子脂质体的创新与发展，将为人类提供更多的治疗选择。