鲁氏酵母菌QOR6产呋喃酮发酵条件优化及代谢特征分析

彭 辉，姜 鹏, ，李 忍，刘 念，李志江,

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319；2.黑龙江省杂粮加工及质量安全工程技术研究中心，黑龙江大庆 163319）

鲁氏酵母菌（Zygsoaccharomyces rouxii）是嗜高渗透的产香菌株，可将糖类代谢转化为高级醇、芳香族化合物以及具有焦香气味呋喃酮（4-hydroxy-2,5-dimethyl-3（2H） furanone，HDMF）等，这些物质常被作为增香剂，对食品风味具有很大的影响[1-2]。常见代谢合成HDMF菌株有鲁氏酵母、毕赤酵母、乳酸菌等[3]。鲁氏酵母菌是目前报道中生物合成HDMF最主要的菌株，在添加D-果糖和NaCl的培养基中发酵5 d，鲁氏酵母菌合成HDMF产量可达到6.77 mg/L[4]。毕赤酵母在培养4 d时HDMF产量最高约为2 mg/L，乳酸菌在培养3 d时HDMF产量达到1.17 mg/L[5]。研究表明，鲁氏酵母菌在食品加工中具有安全性高、无毒副作用等优点。其在酱油、香醋和豆酱中均起到重要的呈味效果[6-7]。鲁氏酵母菌也可提高香肠的口感与风味[8]。国内外对于鲁氏酵母菌产香的研究多集中在传统高盐发酵食品中，关于其他食品产业的应用报道相对较少。利用气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术评价了鲁氏酵母菌参与的发酵葡萄酒样品，检测了葡萄酒中的高级醇、果香和花香气味等风味物[9-10]。

本实验室采用基因工程技术，利用醌氧化还原酶（Quinone oxidoreductase，QOR）构建Z. rouxii QOR过表达工程菌，QOR是酵母菌利用果糖-1,6-二磷酸（Fructose-1,6-bisphosphate, FBP）代谢合成HDMF的重要催化酶[11]。筛选得到的高产HDMF菌株QOR6，QOR基因表达量相比于出发菌株提高了4.8倍（未发表结果）。但其代谢合成HDMF发酵条件及代谢特征未见报道。因此，本文深入研究鲁氏酵母菌QOR6发酵合成HDMF条件，有利于鲁氏酵母菌改善食品风味，推动其在食品增香中的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲁氏酵母菌QOR6 本实验室构建；YPD液体培养基：20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖，10 g/L酵母提取物；YPD固体培养基：20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖，10 g/L酵母提取物，琼脂；HDMF标品 美国Sigma公司；甲醇、乙腈和甲酸（色谱级） 百灵威科技有限公司。

MLS-830L立式压力蒸汽灭菌锅 普和希健康医疗器械（上海）有限公司；Opti-Clean 1300垂直流洁超净工作台 立新仪器（上海）有限公司；SB25-12DTD超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；H1850R台式高速离心机 湘仪离心机仪器有限公司；显微镜 上海永科光学仪器有限公司；ZQLY-300V立式双层振荡器 上海知楚仪器有限公司；ZXSP-B0270生化培养箱 上海智城分析仪器制造有限公司；PB-10/C酸度计 北京赛多利斯仪器系统有限公司；1290 UHPLC型超高效液相色谱仪安捷伦科技有限公司；ITQ 1100型气相色谱质谱联用仪 赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株的活化与培养 参考Liu等[12]方法并稍作改动。取冻存的鲁氏酵母菌QOR6，在灭菌后的YPD固体培养基中划线，于恒温培养箱中在28 ℃的条件下培养3 d。挑取单菌落移至装有100 mL YPD液体培养基的250 mL三角瓶中，于全温振荡器中在28 ℃、180 r/min条件下培养3 d，当细胞总数达到2.5×108～3.0×108CFU/mL时备用。取5 mL已活化好的菌液接种到100 mL YPD培养基中，在全温振荡器中28 ℃、180 r/min条件下培养27 h作为种子液用于后续试验。

1.2.2 HDMF的测定 根据Li等[13]的研究方法并稍作修改。取培养后的发酵液在4 ℃条件下8000 r/min离心10 min，移液枪精准吸取2 mL上清液，经0.22 μm滤膜过滤后采用HPLC测定HDMF含量。液相色谱条件：UPLC BEH-Amide（1.7 μm,2.1 mm×100 mm），流动相为0.1%甲酸（A）和乙腈（B），洗脱梯度为：0～10 min，5%B；10～15 min，20%B；15～20 min，100%B。流速1 mL/min，柱温25 ℃，进样量10 μL，检测波长287 nm，使用外标法定量。

1.2.3 鲁氏酵母菌QOR6合成HDMF产量的发酵条件优化 将不同浓度的种子液接种到YPD培养基中，采用控制变量法进行单因素实验，以发酵温度28 ℃、pH4.7、转速180 r/min、接种量20×107CFU/mL、发酵时间3 d作为基础培养工艺参数[13]，分别考察温度（24、28、32和36 ℃）、初始pH（5.7、5.2、4.7、4.2和3.7）、转速（160、180、200和220 r/min）、接种量（2×107、5×107、20×107和50×107CFU/mL）等因素对QOR6合成HDMF产量的影响。

根据单因素实验结果，设计4因素3水平的正交试验，确定QOR6的最佳发酵参数。正交试验因素水平见表1。

表1 正交试验L9（34）因素水平表Table 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal test

1.2.4 挥发性物质测定

1.2.4.1 待测样品制备 离心后的发酵液中加入液氮迅速冷冻研磨粉碎，称取适量粉碎样品，于顶空瓶中，加入2 g饱和氯化钠，压盖，置于80 ℃水浴中平衡20 min，再将固相微萃取针扎进顶空中，继续放入80 ℃水浴中20 min，上机检测。

1.2.4.2 GC-MS测定条件 GC条件：TG-5 MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升温：初始温度50 °C，保持3 min以后，6 ℃/min的升温速度升至250 ℃，保持5 min。载气为高纯氦气，流速1.0 mL/min；进样量1.0 μL。

MS条件：电离方式为EI，电子能量为70 eV，接口温度为250 ℃，离子源温为230 ℃，四级杆温度为200 ℃，无溶剂延迟，全扫描方式，质量扫描范围40～650 m/z。

挥发性物质定性定量分析：采集到的质谱图利用NIST谱库进行检索，鉴定样品中的挥发性成分，并利用面积归一化法分析各成分的相对含量。

1.3 数据处理

实验每组3个平行样品，结果用平均值±标准差来表示。利用SPSS 25.0进行数据分析和Prism 8.0制图。采用单因素方差分析及Duncan检验比较各组数据，P＜0.05表示样品间具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 发酵温度对鲁氏酵母菌QOR6合成HDMF产量的影响

随着发酵温度的增加，发酵液中的HDMF产量呈现出先升高后降低的趋势（图1）。当发酵温度为36 ℃时，发酵液中的HDMF含量最低为1.56 mg/L；当发酵温度为28 ℃时，HDMF含量达到最高为2.65 mg/L，显著高于其他样品（P＜0.05）。因此，当发酵温度在28～32 ℃时适宜鲁氏酵母菌QOR6生长，这与康远军等[14]研究结果相一致。研究表明，在发酵过程中，发酵温度主要通过影响酵母体内生物酶活性来调控生长和代谢活性[15]，当发酵温度过高时，细胞内酶的催化活性受到抑制导致代谢产物降低。因此，鲁氏酵母菌QOR6产HDMF的最佳发酵温度为28 ℃，并在此温度下用于研究后续实验。

图1 不同发酵温度条件下QOR6合成HDMF产量Fig.1 HDMF production from Z. rouxii QOR6 under different fermentation temperatures

2.2 初始pH对鲁氏酵母菌QOR6合成HDMF产量的影响

初始pH对鲁氏酵母菌QOR6产HDMF含量的影响如图2所示。随着发酵液初始pH的增加，发酵液中的HDMF含量呈现出先升高后降低的趋势。在初始pH为4.2时，发酵液中的HDMF含量最高为2.18 mg/L，显著高于其他实验组（P＜0.05）。当初始pH为5.7时，发酵液中的HDMF含量最低。因此，鲁氏酵母菌适合在较低酸性的条件下生长代谢，当初始pH为4.2时有利于鲁氏酵母菌QOR6生长和代谢。

图2 不同初始pH条件下QOR6合成HDMF产量Fig.2 HDMF production from Z. rouxii QOR6 under different initial pH

研究表明，在发酵过程中，适宜的初始pH有利于提高发酵过程中微生物中酶的活性，从而促进其生长代谢[16]。鲁氏酵母菌可在pH1.5～10.5的范围内生长，且最适生长范围在3.5～5.0[3]，这与本文的研究结果相类似。因此，将培养基pH调至4.2作为初始pH用于后续研究。

2.3 转速对鲁氏酵母菌QOR6合成HDMF产量的影响

培养转速对鲁氏酵母菌QOR6产HDMF产量的影响如图3所示。随着转速的增加，发酵液中的HDMF含量呈现出先升高后降低的趋势。在培养转速为180 r/min时，发酵液中的HDMF含量最高为2.6 mg/L（P＜0.05）。而当培养转速为220 r/min时，发酵液中的HDMF含量最低为1.76 mg/mL。

图3 不同转速条件下QOR6合成HDMF产量Fig.3 HDMF production from Z. rouxii QOR6 under different agitation speeds

鲁氏酵母属于兼性厌氧菌，在有氧环境更适宜生长，适当的摇瓶培养可以为酵母生长提供充足的氧气，利于前期细胞数目的积累[17]。转速过高导致发酵液中HDMF含量降低的原因可能是由于供氧充足时，导致细胞数目增加，耗氧量高，酵母快速生长而代谢产物减少[18]。因此，后续实验培养转速为180 r/min。

2.4 接种量对鲁氏酵母菌QOR6产HDMF产量的影响

接种量对鲁氏酵母菌QOR6产HDMF含量的影响如图4所示。随着接种量的增加，发酵液中的HDMF含量呈现出先升高后降低的趋势。在接种量为20×107CFU/mL时，发酵液中的HDMF含量最高为1.54 mg/L，显著高于其他实验组（P＜0.05）；当接种量为2×107CFU/mL时，发酵液中的HDMF含量最低。因此，当接种量为20×107CFU/mL时，有利于鲁氏酵母菌QOR6代谢。研究表明，酵母接种量对细胞的生长代谢具有显著的调节作用[19]。随着发酵接种量的增加，发酵液中的HDMF含量呈现出先升高后降低，可能是由于接种量过低，酵母细胞数量少，代谢出的目标产物少。而接种量较高，细胞间竞争加剧，营养物质或氧气不足导致酵母细胞生长缓慢[18]。

图4 不同接种量条件下QOR6合成HDMF产量Fig.4 HDMF production from Z. rouxii QOR6 under different inoculation amounts

2.5 正交试验结果

正交试验结果表明（表2），影响QOR6合成HDMF的因素顺序为：温度（A）＞转速（C）＞初始pH（B）＞接种量（D）。方差分析结果表明（表3），温度、转速和初始pH对QOR6发酵生产HDMF具有显著影响（P＜0.05），而接种量对HDMF产量无显著影响（P＞0.05）。正交试验优化得到的条件为：发酵温度28 ℃、初始pH4.2、转速180 r/min、接种量20×107CFU/mL。此条件下，测得HDMF产量高达2.90 mg/L。由于外源D-果糖和NaCl对鲁氏酵母产HDMF具有促进作用，因此与前人研究结果6.77 mg/L存在差异[4]。

表2 正交试验结果Table 2 Result of orthogonal test

表3 方差分析结果Table 3 Analysis of variance

2.6 挥发性物质分析

在最优发酵条件下，利用GC-MS技术测定鲁氏酵母菌QOR6代谢合成的挥发性物质，结果如表4所示。

2.6.1 醇类挥发物质分析 醇类物质主要是鲁氏酵母菌通过糖酵解途径产生，表现为甜香和花果香[20-21]。样品中共检测出7种醇类（表4），占总挥发物的81.13%。主要有异丁醇（酒精气味）、异戊醇（花香，水果香）、叔戊醇（焦灼味）和苯乙醇（清甜的玫瑰样花香）等[22]。其中含量最多的是苯乙醇，占总挥发物的56.58%，是由苯丙氨酸代谢出的一种具有玫瑰香味的芳香醇，因其嗅闻强度较高，是果酒中常见的香气活性物质[23]。赵培城等[24]在研究绍兴黄酒的香气物质时发现，醇香的主要贡献来源是苯乙醇和异戊醇。因此，鲁氏酵母菌QOR6也能够增加食品的甜果香，可应用于食品发酵。

2.6.2 酯类挥发物质分析 酯类物质通常由发酵期间微生物代谢作用及醇类和有机酸的酯化反应生成[25]。样品共检测出10种酯类（表4），占总挥发物的6.49%。主要有苯乙酸乙酯（花香，蜂蜜香）、乙酸苯乙酯（花香和水果香）、2-甲基丁酸，2-苯乙酯（月季花香、甜果香和蜡烛气味）等[26]。其中乙酸苯乙酯的占比最大为3.48%，是风味物质中花果香气的主要来源。酯类物质对白酒风格形成具有重大意义，不同香型的白酒中，酯类的种类及含量不同[27]。酯类物质也是酱类发酵食品中主要香气贡献成分，酱油中的酯类化合物是已报道物质中品种最多的[28]。因此，在发酵过程中添加鲁氏酵母菌QOR6，可以增加食品的花果香气。

表4 挥发性化合物GC-MS测定结果Table 4 Results of volatile compounds by GC-MS detection

2.6.3 醛类挥发物质分析 醛类化合物主要来源于糖类与氨基酸作用，阈值较低，具有脂肪香气[29]。样品中共检测到8种醛类（表4），占总挥发物的1.32%。主要有巴豆醛（臭味）、异戊醛（青草香、巧克力香味）、苯甲醛（苦杏仁、樱桃及坚果香）、苯乙醛（风信子花香和甜果香）、壬醛（玫瑰、柑橘和油脂气味）、3,4-二甲基苯甲醛（杏仁味）和4-戊烯醛[30]等，其中苯甲醛的占比最大为0.34%。发酵过程中醛类的生成量虽少，但对香气成分的贡献很大。醛类物质在肉制品加工中对风味的影响突出，含有小分子量的醛时，可使产品整体的风味更醇厚。李永杰等[31]在风干肠中检测到壬醛，由不饱和脂肪酸的自动氧化而成，有较强的油脂味，对发酵肉制品的香味有重要贡献。刘丹丹等[32]在对酱牛肉风味物质测定时，发现醛类是最主要的风味来源，其中苯甲醛含量最高。因此，鲁氏酵母菌QOR6的添加，能增强食品的油脂香，可在肉制品中进行应用。

2.6.4 芳香族化合物及烃类挥发性物质分析 发酵液中共检测到5种芳香族化合物（表4），占总挥发物的1.19%，其中3-乙基-2,5-甲基吡嗪含量最高为0.70%。芳香族化合物的产生主要由醛和烯醇进一步环化生成的吡嗪和吡啶。发酵液中共检测到4种烃类化合物（表4），占总挥发物的0.50%，其中氯甲氧基甲烷含量最高为0.20%。烃主要来源于脂肪酸醇氧自由基的均质化和脂肪降解，一般会有所谓的烷烃气味，其中阈值较低的不饱和烃对香气贡献较大[33-34]。烯烃和烷烃类大多属于小分子物质，在发酵前期，可作为营养物质，经酵母发酵进一步合成酯类物质[35]。

2.6.5 其他挥发性物质分析 发酵液中产生的其他挥发性物质，主要有酰胺类、酚类、酸类和醚类，占总挥发物的9.42%。酰胺类物质对风味没有显著贡献，具有一定刺激性气味。酸类物质是醇和醛氧化产生，多作为非挥发性香气物质存在于发酵液。醚类可能是在高温下，由醇脱水化合而成。样品中只检测到1种酚类为2,6-二叔丁基苯酚，其相对含量为8.77%，也有学者在糯米酒、熟制香菇和软儿梨果酒等食品挥发性成分中检测到该物质[36-37]。上述各种物质间的相互作用，使得鲁氏酵母菌QOR6代谢出的挥发性香气成分更为丰富。

3 结论

本研究对鲁氏酵母菌QOR6代谢合成HDMF培养条件进行了优化，并对其代谢出的挥发成分进行分析，为酵母因酿造方式带来的环境改变提供适宜的发酵参数。最终确定该菌株产HDMF最优培养条件：发酵温度28 ℃、初始pH4.2、转速为180 r/min、接种量为20×107CFU/mL。在此条件下，合成的HDMF产量为2.90 mg/L。此外，代谢得到的醇、酯、醛类化合物种类丰富，检测到有苯乙醇、异戊醇、乙酸苯乙酯、苯甲醛等关键香气成分，他们的呈味效果将更突出，使发酵液整体呈现出甜果香及坚果的香气。由此可见，鲁氏酵母菌不仅可以提高HDMF的含量，还能显著改善发酵液风味。后续可在此研究基础上，对风味物质形成的特定代谢途径以及相关的调控基因进行挖掘。研究结果可为鲁氏酵母菌基因改造菌株进一步研究，以及利用其呈味特征在食品工业中的应用提供技术参考。