冻藏条件对带鱼鱼肉及其鱼糜凝胶特性的影响

白雯璐，张文海，焦熙栋，闫博文，张娜娜，叶伟建，陈江平，黄建联，范大明,3,

（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122；2.江南大学食品学院，江苏无锡 214122；3.农业农村部水产加工冷藏与调理重点实验室，福建厦门 361022；4.福建省冷冻调理水产品加工重点实验室，福建厦门 361022；5.福建安井食品股份有限公司，福建厦门 361022）

带鱼（Trichiurus lepturus）又名刀鱼、裙带、牙带鱼等，属鲈形目带鱼科[1]水产动物，是我国东南沿海产量最高的经济鱼类，2020年带鱼海洋捕捞产量达90.3万吨[2]。近年来，随着海洋资源的不断萎缩，传统海水鱼加工鱼糜原料愈益减少，而带鱼的生产和消费仍在增长。由于带鱼对水压等生存条件比较敏感，捕获后很快就会死亡且无法进行人工养殖，目前多以冻品流通和销售。

在冷冻的条件下，细菌的氧化代谢及酶活性受到一定程度抑制[3]。随着冻藏时间的延长，鱼肉在内源酶、细菌代谢酶等物质的作用下，蛋白结构会发生变化，导致鱼肉色泽变差、持水力下降、质构软化等问题[4-6]。此外，鱼类肌肉组织中所含有的脂质也会在冻藏过程中发生氧化，进一步通过诱导交联导致蛋白质变性[7-8]。冻藏过程中的冰晶形成也会导致其肌原纤维蛋白功能特性的下降。栾兰兰[9]将带鱼置于-5、-20、-40和-80 ℃冻藏49 d，建立了基于分形维数的冷冻带鱼品质的评价方法，发现水分活度值、色差值、硬度、弹性等指标表现出不同程度的下降趋势，冻藏温度越低，指标下降幅度越小。随着冻藏时间的延长，带鱼品质因发生一定程度的劣变而不能流入餐饮业进行加工和食用，但其中符合国家安全标准的带鱼可作为低值原料加工成冷冻鱼糜，起到为鱼糜制品提供风味、降低成本等作用。

冷冻鱼糜是低值冻带鱼主要的加工形式之一，其由带鱼肉经过漂洗、斩拌等工序制成[10]。目前现有研究主要集中在对带鱼品质保鲜[11]、带鱼鱼糜深加工及重组鱼糜制品的加工[12]等方面。然而，不同冻藏温度及冻藏时间条件下，带鱼鱼肉理化特性变化规律及其带鱼鱼糜凝胶特性变化相关性研究仍较少，难以为带鱼的冻藏保存及品质改善提供理论参考。

本研究探究了冻带鱼在实测常见冻藏温度-7 ℃（超市冷柜）、-13 ℃（家用冰箱）、-18 ℃（工厂冷库）、-23 ℃（国标）下冻藏四个月过程中的变化，研究带鱼冻藏过程中鱼肉理化特性（羰基、巯基、Ca2+-ATPase活性、TBARS）及鱼糜凝胶特性（色泽、凝胶强度、持水力、微观结构）的变化规律，为进一步优化带鱼的冻藏及品质改良提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

带鱼 购自浙江省舟山市东海海域；乙二胺四乙酸、2,4-二硝基苯肼、5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸） AR级，国药化学试剂有限公司；蛋白质羰基含量检测试剂盒、超微量Ca2+-ATPase酶试剂盒 南京建成生物工程研究所。

UMC5真空斩拌锅 德国STEPHAN Universal Machines公司；SDU506手动式U型打扣机 佛山市志道贸易有限公司；手动灌肠机 临沂市凯莱饮食机械有限公司；两槽恒温水浴锅 上海析达仪器有限公司；SECURA124-1CN型电子分析天平 苏州赛恩斯仪器有限公司；双开门冰箱 德国西门子公司；FX36型高速乳化均质机 德国弗鲁克公司；Ultra Scan Pro1166型高精度分光测色仪 美国Hunterlab公司；RT5PS25型加热磁力搅拌器 德国IKA公司；DHG-9055A热风循环烘箱 上海和呈仪器有限公司；Z366K型高速冷冻离心机 德国Hermle公司；1510全波长酶标仪 美国Thermo Fisher公司；三层冷冻干燥机 德国Labconco公司；S-4800场发射扫描电子显微镜 日本日立株式会社。

1.2 实验方法

1.2.1 带鱼鱼肉及其凝胶制备 将新鲜带鱼拭干表面多余水分，置于-30 ℃快速冻结2 h。随后，将其分为四组，分别置于-7、-13、-18、-23 ℃条件下冷冻贮藏。期间，分别在冻藏15、30、45、60、75、90、105和120 d时，将带鱼取出置于4 ℃解冻12 h，取带鱼肉用于鱼肉理化指标（羰基、巯基、Ca2+-ATPase活性、TBARS）的测定。

参照Cao等[13]法制作鱼糜凝胶，对清洗后的带鱼进行处理（去头与去内脏），采用4 mm孔径进行采肉。四倍体积的冷水漂洗3次，并用脱水机将鱼糜脱水至78%～80%。经过2 mm孔径精滤，用斩拌锅以1500×g的离心力斩拌2 min，随后加入3%（W/W）的盐继续斩拌3 min，整个鱼糜凝胶制作过程控制在10 ℃以下。斩拌结束后，将鱼糜灌入塑料肠衣。水浴40 ℃处理30 min，90 ℃处理20 min后迅速冷却，并置于4 ℃冰箱12 h用于鱼糜凝胶指标（色泽、凝胶强度、持水力、微观结构）的测定。

1.2.2 羰基含量的测定 参照蛋白质羰基测试盒中的使用说明进行不同冻藏条件下带鱼鱼肉羰基含量测定[14]。计算公式为：

式中：OD1代表样品的吸光度值；OD2代表对照组的吸光度值；n代表比色光径；m代表样品蛋白浓度。

1.2.3 巯基含量的测定 参照Zhao等[15]法，稍作修改。取4 g鱼肉与20 mL缓冲溶液Q1混合（0.6 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，4 ℃）。均质后离心取上清，Brandford法测定蛋白浓度，并将其稀释到4 mg/mL。取0.5 mL上述溶液并加入4.5 mL 0.2 mmol/L Tris-HCl缓冲液（含有3 mmol/L EDTA，8 mol/L尿素，1%（W/V）SDS，pH8.0）混合均匀。取4 mL上述混合液加入0.5 mL 10 mmol/L的DTNB溶液（pH8.0），混合均匀后40 ℃条件下放置25 min。使用分光光度计测定其吸光度值，波长设为412 nm。巯基含量（-SH）的计算公式为：

式中：A代表吸光度值；B代表蛋白质浓度；C代表摩尔消光系数13600/（L/mol·cm）；D代表稀释比例。

1.2.4 Ca2+-ATPase活性的测定 参照ATP酶试剂盒中的使用说明测定[16]。计算公式为：

式中：A代表测定样品吸光度值；B代表对照样品吸光度值；C代表标准样品吸光度值；D代表空白样品吸光度值；m代表样品蛋白浓度；2.8**代表酶促反应体系稀释倍数（280 μL/100 μL）；6*代表反应时间。

1.2.5 TBARS值的测定 根据GB 5009.181-2016《食品安全国家标准食品中丙二醛的测定》中的分光光度法[17]，略作修改。取鱼肉5.00 g加入50 mL三氯乙酸混合液，冰浴匀浆并离心，上清中加入5 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液，混匀90 ℃反应30 min，冷却后，在532 nm处测定样品溶液的吸光度值，丙二醛含量由1,1,3,4-四乙氧基丙烷标准曲线确定，标准曲线及TBARS值的计算公式为：

式中：y代表吸光度值；x代表TBARS值。

1.2.6 鱼糜凝胶色泽的测定 将鱼糜凝胶等间距切割，间隔距离为2.5 cm。用Ultra Scan Pro1166型高精度分光测色仪在室温下测定鱼糜凝胶样品的亮度值L*，红度值a*和黄度值b*[18]，每组样品平行测定3次。

1.2.7 凝胶强度的测定 参照Yan等[19]的方法，将处理后的鱼糜凝胶等间距切割，间隔距离为2.5 cm。采用穿刺法测定鱼糜的凝胶强度，选用的穿刺探头为P/5S球型探头，球型探头下降速度为2.00 mm/s，接触力为5 g，测试速度为1.00 mm/s，下压距离为15 mm，返回速度为10.00 mm/s。鱼糜的凝胶强度的计算公式为：

1.2.8 持水力测定 新鲜的鱼糜凝胶切成2 mm左右的薄片并准确称取4～5 g记录重量m1，将称取的鱼糜凝胶薄片包裹在4层滤纸中并放置在离心管的底部。配平后的离心管在4 ℃下5000×g的条件下离心20 min。离心完成后立即去除滤纸，并准确称取离心后的鱼糜凝胶质量m2[20]。持水力可按下式计算：

式中：WHC表示持水力；n表示水分含量；m1表示离心前鱼糜凝胶重量；m2表示离心后鱼糜凝胶重量。

1.2.9 微观结构观察 参照Yan等[21]的方法，将鱼糜凝胶切成薄片，并进行固定、脱水、冷冻干燥后，使用扫描电子显微镜在10 kV的加速电压下进行观察。

1.3 数据处理

实验中分别采用Microsoft Excel 2018软件、Origin Pro 8.5软件进行实验结果统计、绘制分析图。实验数据都按照“平均值±标准差”来表示。

2 结果与分析

2.1 冻藏过程中带鱼鱼肉的蛋白质羰基含量变化

蛋白质羰基化是蛋白质复杂的氧化变性形式之一，目前作为评价蛋白氧化最广泛的指标。如图1所示，新鲜带鱼的羰基含量为（1.78±0.21） nmol/mg蛋白，随着冻藏时间的延长，带鱼受到活性氧自由基等物质的攻击，形成羰基等衍生物[22]，因此4种冻藏条件下带鱼鱼肉羰基含量均呈上升趋势。在-7 ℃冻藏条件下，从第0 d到第120 d，羰基含量逐渐上升至最大值（11.67±0.13） nmol/mg。由于低温对氧活性及化学反应势能的抑制，冻藏温度越低羰基含量上升速率越低。这一结果与汪经邦等[23]研究暗纹东方鲀在10、4和-3 ℃贮藏26 d后肌原纤维蛋白氧化趋势类似，冻藏温度较高时，鱼肉蛋白羰基化更严重。而在冻藏后期，羰基化的速率略有减缓，可能由于冻藏前期以蛋白氧化为主，蛋白降解较少，而冻藏后期羰基化的蛋白逐渐被降解，因此蛋白羰基化速率减缓。

图1 不同冻藏条件对带鱼鱼肉羰基含量的影响Fig.1 Effects of different frozen storage conditions on carbonyl content of hairtail fish

2.2 冻藏过程中带鱼鱼肉的蛋白质巯基含量变化

半胱氨酸的巯基（SH）是蛋白质中最具活性的官能团之一，极易氧化成二硫键（S-S），对蛋白质高级结构的维持具有重要作用[24]。不同温度冻藏过程中带鱼肌肉巯基含量的变化如图2所示。由图2可以看出，四组样品的巯基含量均随冻藏时间的延长呈现明显下降的趋势，且温度越低巯基含量越高。在冻藏120 d后，-7、-13、-18和-23 ℃冻藏条件下的巯基含量由最初的（10.48±0.17） mol/105g分别降至（4.57±0.06）、（5.319±0.11）、（5.72±0.27）和（5.79±0.09） mol/105g。说明随着冻藏时间的延长，蛋白区域结构的改变使肌球蛋白构象发生变化，使埋在分子内部的活性巯基暴露，遭到活性氧的攻击从而巯基含量下降。周果等[25]研究发现4 ℃比-3 ℃条件下贮藏的金枪鱼肉更易氧化，贮藏温度越高，位于肌球蛋白内部巯基的越容易暴露，也会加快巯基的氧化速度。

图2 不同冻藏条件对带鱼鱼肉巯基含量的影响Fig.2 Effects of different frozen storage conditions on sulfhydryl group (-SH) of hairtail fish

2.3 冻藏过程中带鱼鱼肉的蛋白质Ca2+-ATPase活性变化

Ca2+-ATPase的活性受巯基活性部位调节，当肌球蛋白结构改变时，其头部的巯基被丝状蛋白质覆盖，处于肌球蛋白头部的SH1和SH2改变，造成与ATP接触减少，使Ca2+-ATPase活性降低[26]。由图3中可以看出，随着冻藏时间的延长Ca2+-ATPase活性不同程度下降，且与巯基含量的下降具有很好一致性，说明肌球蛋白结构出现不同程度损伤。在带鱼冻藏过程当中，鱼体肌肉组织中形成的冰晶会引起肌球蛋白头部结构改变[27]。-7 ℃冻藏的样品，Ca2+-ATPase活性下降最严重，说明在该温度下蛋白质分子变性程度较大，而随着冻藏温度的降低，蛋白劣变过程被延缓，因此冻藏温度越低，蛋白的变性程度越低。石钢鹏等[28]研究了速冻方式对冷冻贮藏中大口黑鲈鱼肉Ca2+-ATPase活性的影响，发现-18 ℃的冻藏温度下，不同贮藏方式Ca2+-ATPase活性均显著下降，与本研究得出相似趋势。

2.4 冻藏过程中带鱼鱼肉的TBARS值变化

带鱼皮下富含脂质，在冻藏过程中脂质容易发生氧化产生大量过氧化物。在过氧化物酶的作用下，过氧化物分解生成氧化二级产物，如醛（丙二醛）、酮、脂肪酸等[29]。其中，丙二醛可与硫代巴比妥酸反应生成颜色，因此该反应可用于测定脂质氧化程度[30]。不同冻藏温度下带鱼TBARS值随冻藏时间的变化如图4所示。四种冻藏温度下，带鱼TBARS值均有所增加。其中-7 ℃下冻藏的带鱼TBARS值增长速度最快，其次是-13、-18和-23 ℃，脂质的氧化速度随着温度的降低而降低，冻藏120 d后分别增至（0.81±0.04）、（0.50±0.01）、（0.37±0.03）和（0.32±0.01mg） MDA/kg。更低的温度下氧分子运动速率减慢，脂质氧化的进程受到明显抑制。有研究表明脂质的氧化会一定程度上导致蛋白的氧化，而TBARS值较蛋白羰基值变化有显著差异，说明除了脂质氧化诱导蛋白氧化还存在其他因素，如氧自由基、酶的攻击等[31]。Ke等[32]认为海产品TBARS值低于0.58 mg MDA/kg即认为未达到腐败阶段，0.58～1.51 mg MDA/kg轻微腐败，但可接受；高于1.5 mg MDA/kg被认为是腐败。因此，本研究中-13、18、-23 ℃冻藏的带鱼均未达到腐败阶段。-7 ℃冻藏的带鱼在前60 d不腐败，在后期的冻藏过程当中轻微腐败。

图4 不同冻藏条件对带鱼鱼肉TBARS变化影响Fig.4 Effects of different frozen storage conditions on TBARS value of hairtail fish

2.5 冻藏过程中带鱼的鱼糜凝胶色泽变化

鱼糜凝胶的色泽直接受到鱼肉色泽的影响。鱼肉的亮度值L*的变化与贮藏温度密切相关，在冰点以上温度贮藏时，主要受到蛋白溶解度、汁液流失增加的影响，亮度值L*增加；在冰点以下温度贮藏时，主要受到氧化作用使得亮度L*值降低[33]。图5显示了冻藏期间带鱼所制成凝胶的亮度值L*、红度值a*、黄度值b*，由图5可见，随着冻藏时间的延长，冻带鱼所制成的凝胶色泽逐渐劣变。四种温度的亮度值L*值分别从（72.11±0.16）降至（66.61±0.16）、（67.88±0.25）、（68.17±0.15）和（68.99±0.17），红度值a*、黄度值b*随着冻藏时间的延长逐渐升高，冻藏温度越低上升幅度越小。TBARS值的变化趋势与黄度值b*的变化趋势相似，说明脂肪的氧化一定程度上导致了鱼糜凝胶黄度值的增加，可能由于带鱼鱼肉在冻藏过程当中，所含的丰富的不饱和脂肪酸逐渐在光、活性氧分子存在的条件下逐渐氧化生成复合物，颜色发生褐变，且在鱼糜凝胶制作过程当中的漂洗阶段不能作为脂肪等密度较小的物质漂浮在水面进行去除，残留在鱼糜当中，导致制成的凝胶色泽加深[34]。带鱼虽然肉色呈白色，肌肉中仍含有少量的肌红蛋白，在冻藏过程中，酶或细菌的繁殖等使得肌红蛋白逐渐被氧化成高肌红蛋白[35]，导致颜色褐变，亮度下降。其中-23 ℃冻藏的带鱼所制成的凝胶色泽劣变程度最低，说明较低温度能有效保持带鱼鱼糜凝胶的新鲜品质，减缓其脂肪氧化与蛋白氧化所带来的色泽劣变。随着冻藏温度的升高，带鱼的保鲜效果越来越差，所制成的鱼糜凝胶色泽亮度值L*逐渐下降。红度值a*随冻藏温度的升高逐渐增加，-7 ℃温度的带鱼在冻藏30 d以后，红度值升高的速度加快，说明带鱼在-7 ℃冻藏30 d后氧化速度逐步增快，加速了品质的下降。

图5 冻藏过程中带鱼鱼糜凝胶色泽的变化Fig.5 Changes in the color of surimi gel during storage

2.6 冻藏过程中带鱼的鱼糜凝胶强度变化

不同温度和不同冻藏时间对冻带鱼凝胶强度的影响如图6所示，可以看出，冻带鱼鱼糜凝胶强度在四种温度下随着冻藏时间的增加而逐渐降低。-7 ℃冻藏的带鱼所制成的鱼糜凝胶其强度的下降速率先增后减，在冻藏前期鱼体表面大量蛋白质在酶、氧气等物质的作用下，蛋白质的变性导致鱼糜在形成凝胶过程中无法充分交联导致其凝胶强度降低[36]。而在冻藏后期，一方面由于氧气、细菌等进入鱼体组织内部受阻，并且在冻藏前期影响凝胶性能的大部分蛋白质已经发生降解[37]，因此出现了在冻藏后期-7 ℃下冻藏的带鱼所制成的鱼糜凝胶强度速率减小的现象。随着冻藏温度下降，带鱼所制成的凝胶具备较好的凝胶强度，说明更低的冻藏温度抑制了鱼糜凝胶中蛋白质劣化反应的发生，从而提升了其凝胶强度[38]。

图6 冻藏过程中带鱼凝胶强度的变化Fig.6 Changes in the strength of surimi gel during storage

2.7 冻藏过程中带鱼的鱼糜凝胶持水力变化

凝胶的持水力主要与凝胶内部结构及化学作用力有关，蛋白结合越紧密，水分保留越充分。在凝胶的制作过程当中，肌原纤维蛋白受热结构改变发生交联聚集，且分子间相互缠绕构成三维网状结构[39]。而肌球蛋白具有较强的亲水性，形成的网状结构中包含大量的游离水，因此持水力越好，则说明凝胶网络结构越致密。由图7可知，随着冻藏时间的延长，凝胶的持水力逐渐下降，且下降趋势与凝胶强度下降趋势相似。-7 ℃冻藏的带鱼所制得的凝胶持水力下降最严重，-23 ℃冻藏的带鱼所制得的凝胶品质得到了较好保持。此过程的变化主要受肌原纤维蛋白结构的控制，可能由于在冻藏过程中巯基含量及Ca2+-ATPase活性的下降表明肌球蛋白结构遭到破坏，使形成凝胶所必须的交联遭到破坏，凝胶网络劣化，其亲水性发生改变。另一方面冻藏过程中带鱼脂肪的氧化进一步加速了肌原纤维蛋白的改变，导致品质劣化严重从而疏水基团过度暴露，不利于凝胶保持自身水分；随着冻藏时间的延长，持水力下降速率减缓，可能是因为冻藏前期影响热凝胶的蛋白质大量降解，而当蛋白降解到一定程度后，热凝胶过程受蛋白降解的影响减少。冻藏在-23 ℃下的带鱼所制成的凝胶持水力下降速度较缓，说明在较低温度下抑制了肌原纤维蛋白的变性程度。

图7 冻藏过程中带鱼凝胶持水力的变化Fig.7 Changes in the water holding capacity of surimi gel during storage

2.8 冻藏过程中带鱼的鱼糜凝胶微观结构观察

新鲜带鱼所制成的鱼糜凝胶微观结构如图8所示，带鱼受活性氧基团攻击较少，蛋白酶、脂肪等对蛋白的作用时间短[40]，因此新鲜带鱼的盐溶蛋白受到的损伤较小，在斩拌过程中能充分溶出，从而在40 ℃的预凝胶阶段中能够很好进行蛋白质间交联，形成较为致密的网状结构，因此所观察到的凝胶表面观察不到松散的网状结构。然而随着冻藏时间的延长，由鱼肉指标可以看出，蛋白随冻藏时间的增长逐渐羰基化，肌球蛋白头部的巯基含量减少，Ca2+-ATPase活性降低，说明蛋白在冻藏过程中受损严重。因此在冻藏过程中，带鱼鱼肉所制成的鱼糜凝胶其网格结构逐渐变得疏松多孔且孔隙逐渐增大。通过SEM可以很直观地观察到，随着冻藏时间的延长蛋白在凝胶阶段未能很好的形成凝胶，在-7 ℃下冻藏的带鱼鱼肉蛋白劣变最严重，因此所制得的鱼糜凝胶网格结构最为疏松多孔，而随着冻藏温度由-7 ℃到-23 ℃的降低，蛋白的劣变过程受到抑制，因此鱼糜凝胶的结构得到较好的维持。

图8 冻藏过程中带鱼鱼糜凝胶微观结构的变化（4000×）Fig.8 Changes in the microstructure of surimi gels during storage (4000×)

2.9 带鱼鱼肉理化特性与鱼糜凝胶特性的相关性

鱼肉的理化特性往往直接决定鱼糜凝胶的特性[41]。四种冻藏条件下带鱼鱼肉理化特性与鱼糜凝胶特性的相关性如表1所示，羰基含量和TBARS值作为鱼肉氧化相关的指标与色泽具有极显著的相关性。羰基含量、TBARS值与亮度值L*呈极显著负相关（P＜0.01），与a*和b*呈极显著正相关（P＜0.01），即鱼肉氧化越严重，所制成的鱼糜凝胶亮度越低，颜色愈加趋向于红色和黄色，这可能归因于鱼肉贮藏过程中的氧化褐变[39]。巯基含量及Ca2+-ATPase活性作为鱼肉蛋白结构破坏的指标同样显示出与鱼糜凝胶色泽的极显著相关（P＜0.01），鱼肉蛋白结构破坏越严重，所形成的鱼糜凝胶色泽劣变越严重。所有的鱼肉指标均呈现出与鱼糜凝胶强度及持水力的极显著相关（P＜0.01），说明鱼肉氧化程度越高结构破坏越严重，其凝胶形成过程中蛋白交联程度越低，导致凝胶强度与持水力降低[42]。

表1 带鱼鱼肉理化特性与鱼糜凝胶特性的相关性Table 1 Pearson correlations between meat physicochemical characters and surimi gel properties of hairtail

3 结论

在-7、-13、-18和-23 ℃四种冻藏温度下的带鱼，随着冻藏时间的延长，鱼肉理化性质及其鱼糜凝胶特性均下降，在-23 ℃下冻藏时其劣变程度最低。羰基含量和TBARS值含量的上升说明在冻藏过程中鱼肉逐渐氧化，巯基含量和Ca2+-ATPase活性在冻藏期间呈下降趋势，表明肌原纤维蛋白结构逐渐遭到破坏，而更低的冻藏温度能对蛋白结构起到保护作用；冻藏期间蛋白分子结构的破坏使其鱼糜凝胶品质也逐渐发生劣变，凝胶色泽变差，凝胶过程蛋白分子无法充分交联使鱼糜凝胶强度和持水力变差，随着冻藏温度从-23 ℃到-7 ℃的升高，鱼糜凝胶网络也由致密变得疏松多孔，-23 ℃冻藏温度能有效延缓带鱼鱼肉及其鱼糜凝胶的劣变。