玉米赤霉烯酮液相色谱法与酶联免疫法测定结果分析

熊永莉，王生华，康 平，洪维晖，伍 君，彭桂萍，雷 彬

（荆门市农产品质量检验所，湖北 荆门 448000）

1  课题研究背景

玉米赤霉烯酮具有雌激素作用，能造成动物急慢性中毒，引起动物繁殖机能异常甚至死亡，可给畜牧场造成巨大经济损失。因此，国家将其列入食品卫生安全监测的必检项目。目前，检测机构和相关企业一般采用液相色谱法和酶联免疫法测定其含量。其中液相色谱法为国家规定的标准方法。液相色谱法虽然测定结果准确，但其测定方法较为复杂，对仪器要求高，成本大，耗时长，严重影响了生产经营活动的正常开展。酶联免疫法具有操作简单，检测时间短，显著节约成本的特点。本研究旨在对以上两种方法检测结果进行比较，验证酶联免疫法测定结果与液相色谱法测定结果是否一致，从而得出酶联免疫法的适用性和推广应用价值。

2  实验过程与步骤

课题研究小组人员分成两组，对4个含有不同浓度玉米赤霉烯酮的样品分别用酶联免疫法和液相色谱法进行玉米赤霉烯酮含量测定。4个样品分别为：样品1：小麦标准物质玉米赤霉烯酮含量为58ug/kg±9ug/kg；样品2：小麦标准物质玉米赤霉烯酮含量为95ug/kg±12ug/kg；样品3：自备空白基质加标样品，玉米赤霉烯酮加标浓度为20ug/kg；样品4：自备空白基质加标样品，玉米赤霉烯酮加标浓度为150ug/kg。一组实验人员做酶联免疫法，另一组实验人员做液相色谱法，两种实验方法具体如下：

2.1  酶联免疫法（某生物技术有限公司生产的玉米赤霉烯酮ELISA检测试剂盒）

2.1.1   原理

采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔上预包被玉米赤霉烯酮抗原，样本中玉米赤霉烯酮和此抗原竞争玉米赤霉烯酮的抗体（抗试剂），同时玉米赤霉烯酮抗体与酶标二体（酶标物）相结合，经底物显色，样本吸光值与其含有的玉米赤霉烯酮呈负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中玉米赤霉烯酮的含量。

2.1.2  设备及试剂

酶标仪（检测波长450nm）、振荡器、旋涡仪、天平（精度：0.01g）、离心机、离心管、定量滤纸和漏斗、微量移液器、去离子水、甲醇。

2.1.3  溶液的配制

配液1：60%甲醇

用去离子水将甲醇按3：2体积比进行稀释。

配液2：样本稀释液

用去离子水将玉米赤霉烯酮浓缩样本稀释液按1：19体积比进行稀释。

配液3：洗涤液

用去离子水将浓缩洗涤液按1：9体积比进行稀释。

2.1.4  样品前处理

（1）粉碎并称取5.0g有代表性的样品，加入60%的甲醇50ml与其混合；

（2）于振荡器上剧烈震荡10min，转速为150r/min（手摇或者旋涡均需5min）；

（3）取液体于4000r/min离心5min（或者静置3min，再用定量滤纸过滤）；

（4）取上清或滤液0.5ml，再加入4.5ml去离子水；

（5）振荡5s或手摇匀，取50ul进行分析。

稀释倍数：100倍

2.1.5   检测

（1）将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上。

（2）取出需要数量的微孔板，并记录下各标准品和样品的位置，建议均做双孔平行，未使用的板条用自封袋密封后，立即保存于2～8℃环境，切勿冷冻；

（3）加标准品/样品溶液50ul到对应的微孔中，在每孔加入50ulZEN酶标物，最后加入50ulZEN抗试剂。轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光反应30min；

（4）揭开盖板膜，倒掉板孔中液体，在每孔加入250ul洗涤液，充分洗涤4次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；

（5）在每孔中加入底物液A，再加底物液B，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光反应15min；

（6）揭开盖板膜，在每孔中加入50ul终止液，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，设定酶标仪在450nm下读取酶标板吸光度值。

2.2  液相色谱法（食品安全国家标准 食品中玉米赤霉烯酮的测定 GB 5009.209—2016第一法）

2.2.1   原理

用乙腈溶液提取试样中的玉米赤霉烯酮，经免疫亲和柱净化后，用高效液相色谱荧光检测器测定，外标法定量。

2.2.2  仪器和设备

（1）高效液相色谱仪：配有荧光检测器。

（2）高速粉碎机：转速≥12000r/min。

（3）均质器：转速≥12000r/min。

（4）高速均质器：转速18000～22000r/min。

（5）氮吹仪。

（6）空气压力泵。

（7）玻璃注射器：10ml。

（8）天平：感量0.0001g和0.01g。

2.2.3  材料和试剂

（1）材料：玉米赤霉烯酮免疫亲和柱（柱规格1ml或3ml，柱容量≥1500ng，或等效柱。）玻璃纤维滤纸：直径11cm，孔径1.5um，无荧光特性。

（2）试剂：甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、吐温-20、盐酸。

2.2.4  样品前处理

（1）提取。称取40.0g粉碎试样（精确到0.1g）于匀质杯中，加入4g氯化钠和100ml提取液，以均质器高速搅拌提取2min，定量滤纸过滤。移取10.0ml滤液加入40ml水稀释混匀，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液备用。

（2）净化。将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取10.0ml上述中的滤液，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与注射器连接，调节压力使溶液以1滴/s～2滴/s的流速缓慢通过免疫亲和柱，直至有部分空气进入亲和柱中。用5ml水淋洗柱子1次，流速为1～2滴/s，直至有部分空气进入亲和柱中，弃去全部流出液。准确加入1.5ml甲醇洗脱，流速约为1滴/s。收集洗脱液于玻璃试管中，于55℃以下氮气吹干后，用1.0ml流动相溶解残渣，供液相色谱测定。

2.2.5   测定

将待测试样溶液注入高效液相色谱仪，得到玉米赤霉烯酮的峰面积。由标准曲线得到试样溶液中玉米赤霉烯酮的浓度。

3  检测结果数据比较分析（见表1，表2，表3）

表1  酶联免疫法测定结果统计表

表2  液相色谱法测定结果统计表

表3  两种方法检测结果与真实值的误差统计表

4  实验结论

通过对4个含有不同浓度玉米赤霉烯酮的样品，分别用酶联免疫法和液相色谱法进行玉米赤霉烯酮含量测定，分析比较实验结果数据，得出如下结论：

（1）两种方法检测结果技术指标均满足实验标准方法要求。用酶联免疫法测定，4个样品检测结果回收率均在100%±30%范围内（见表1），满足实验要求；用液相色谱法测定，4个样品检测结果相对标准偏差均在15%范围内（见表2），符合标准要求。

（2）酶联免疫法和液相色谱法测定结果比较存在一定的偏差，不是完全一致的。酶联免疫法4个样品检测结果与样品真实值之间误差较大，相对偏差均超过5%（见表3）；液相色谱法4个样品检测结果与样品真实值误差很小，相对偏差均在5%以内（见表3），结果准确可信。

（3）建议基层检验检测机构和粮食企业可以运用酶联免疫法进行初筛，提高检测效率，降低检测成本，方便生产和经营。对于初筛结果值超过国家规定的限量值或需出具检验检测报告的，则用液相色谱法进行测定，以确保检测结果的准确性和权威性。