酯化酶用于酒厂黄水酸性成分再利用的研究进展

江晓钦,唐羽翼，张立，黄张乐，番自琰，韩磊，梅冰*

（1.云南农业大学 建筑工程学院，云南昆明 650000；2.云南农业大学 资源与环境学院，云南昆明 650000；3.四川溢阳环保设备技术工程有限公司，四川成都 610041）

白酒是我国特有的一种蒸馏酒，由原料中的淀粉以及糖类在酒曲的发酵作用下生成。黄水则是在白酒发酵过程中，沉积在窖底的一种具有高COD、BOD的棕黄色、黏稠的有机废水。黄水中含有较多的酸、酯、醇、醛等香味物质，特别是有机酸含量丰富。但黄水杂味较重，且蛋白质、菌体自溶物及果胶质含量较多。

工业上处理黄水主要是用清洁水对黄水进行稀释，并与生产过程中的其他高浓度有机废水混合后进行统一处理。后续的处理工艺主要是利用厌氧处理工艺降低COD和BOD，再用好氧处理工艺去除磷酸盐和氨等。已应用于工程实践且取得较好效果的高浓度有机废水工程治理措施有“水解酸化 +IC+CASS+BAF”工艺[1]、“ABR+SBR”工艺[2]、“UASB-SBR-陶粒过滤”工艺[3]、“AF-ABR-气浮-CASS”工艺[4]等，均可实现废水的达标排放。

但以上处理方式存在一定的水资源浪费以及处理成本过高的问题。因此，如能对黄水中的酸性成分进行有效利用，对于企业而言，在减少高酸废水的处理成本的同时还可以避免资源浪费，提高收益，意义重大。

1 黄水中的酸性成分

黄水是酒厂在生产过程中产生的高酸液体，含有大量的脂肪酸，直接排放将对环境造成严重的污染。研究发现酯化酶可将黄水中的酸转化成脂肪酸甲酯和脂肪酸乙酯，可用于酒的调香及生产。黄水中其他的有机成分为小分子糖、酸、醇和脂类物质，其中主要的酸性成分有乳酸、甲酸、己酸和乙酸，不同酒厂的黄水中酸性成分的含量有一定差异。盛杰等[5]对江苏某酒业生产的黄水进行分析，结果表明其中乙酸含量最多，为7 375.8 mg/L，其次为甲酸。从黄水中丰富的有机酸性成分来看，将其酸性成分进行再利用，可以有效降低黄水中的COD和BOD，从而降低酒厂废水处理难度与处理费用。

2 酯化酶对黄水中酸性成分资源化的利用

浓香型白酒窖内发酵过程中产生的主要液态副产物为黄水，不仅含有丰富的浓香型白酒风味（前体）物质（如醇、醛、酸和酯类等），还含有丰富的营养物质（如淀粉、还原糖、酵母自溶物等），以及大量经长期驯化的酿造微生物。当前，黄水一方面可用于人工窖泥生产、养窖护窖，另一方面可利用黄水中丰富的风味（前体）物质提高原酒品质或生产新型白酒。将复合生物制剂应用在浓香型白酒黄水酯化中，反应后丁酸乙酯及己酸乙酯含量均大幅上升；利用红曲霉或酵母制成的各种酯化酶粗酶制剂对黄水进行酯化，黄水中的酯含量大幅上升，香味物质含量高[6-8]。

酯化黄水酸性成分的酯化酶主要包括脂肪酶、酯合成酶、磷酸酯酶。酯化酶分为胞外酶与胞内酶，胞外酶制备粗酶液可直接进行离心取上清，胞内酶则需进行细胞破碎再离心取上清。通过酯化酶的作用，黄水中的乙酸、己酸、乳酸以及醇类转化为乙酸乙酯、己酸乙酯和乳酸乙酯等白酒中的主体香味成分。应用于黄水酸性成分处理的酯化酶一般来源于酿酒大曲中具有较强产酯化酶能力的菌株。对菌株产酯化酶的最适条件进行试验，通过最大酶活力值来衡量该菌株的酯化能力。细菌、真菌、酵母都可具有产酯化酶能力，侯小歌等[6]发现一部分放线菌也具有产酯化酶能力。目前的研究表明，具有较强酯化能力的菌株主要为红曲霉属（Monascusspp.），如血红红曲霉（Monascus sanguineus）X1，其酯化酶活力可达315.19 U/mL；紫色红曲霉（Monascus purpureus）FBKL3.0018酯化酶酶活最大可达919.12 U/mL[7-8]。此外红曲霉Hm、红曲霉MZ-1、红曲霉H-7、紫色红曲霉LZLJ2103、紫色红曲霉YJX-8、紫色红曲霉EM-56、黑曲霉（Aspergillus niger）T206、黄曲霉（Aspergillus flavus）、、橙色红曲霉（Monascus apelsin）、青链霉菌（Streptomyces lividans）、蓝色链霉菌（Streptomyces azureus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）、伞 状 毛 霉（Lichtheimia corymbifera）、卷枝毛霉（Mucor circinelloides）、伯克霍尔德氏菌（Burkholderiasp.）X10、横 梗 霉（Lichtheimia）HSM、地衣芽胞杆菌（Bacilluslicheniformissp.）G2、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）都具有一定的酯化能力。

经过酯化酶催化转化后生成的黄水酯化液，其COD和BOD含量相比黄水可下降80%左右[7-8]，能直接进行后续的生化处理，无需稀释，节省成本。酯化液中含有大量的脂类及微生物，在提高成品酒品质的同时还可以缩短酿造白酒的发酵周期。因此，酯化液可应用于酿酒的主发酵期后，与低度酒尾按一定比例配合灌入酒窖内进行二次发酵，或在蒸馏丢糟酒前倒入底锅内串蒸。酯化液也可直接进行脱色制成调味酒。

3 酯化酶催化活性的影响因素

酯化酶对黄水中酸性成分的催化活性受到酶的自身活力、酶的浓度、底物浓度、温度、pH、外源物质等诸多因素的影响。

3.1 底物浓度

在生化反应中，若酶的浓度为定值，底物的起始浓度较低时，酶促反应速度与底物浓度成正比；当初始底物浓度较高时，提高底物浓度对加快反应速率的效果降低；当底物浓度达到酶的最大处理极限时，提高底物浓度对反应速率没有影响。唐取来等[9]的研究表明，当底物中乳酸质量浓度较低时（低于8 g/L)，大曲中的酯化酶表现为合成作用，催化乙酸乙酯的合成；随乳酸质量浓度的增加，大曲酯化酶的合成作用减弱；当乳酸质量浓度较高时（高于16 g/L），酯化酶表现为水解作用，将酯分解为相应酸和醇，可能与酶的活性中心改变及底物的竞争抑制作用有关。张浩等[10]研究了己酸、乳酸、丁酸、乙酸的浓度对酯化酶催化的影响，结果表明，当己酸、乳酸、丁酸、乙酸的浓度分别为8 g/L、1 g/L、9 g/L和12 g/L时，大曲酯化酶催化效果最好。

3.2 酶浓度

酶浓度的影响主要体现在菌株的接种量对酶催化转化黄水中酸性成分能力的影响。当菌株的接种量过低时，菌体数量少，催化能力较弱；当接种量过多时，则会快速消耗底物中的营养物质，并产生抑制酯化酶活力的代谢物。研究表明，伞枝犁头霉的最适接种量为4%，红曲霉H-7为1.5%，紫色红曲霉FBKL3.0018为10%，伞状毛霉为5%，红曲霉Hm为10%[11-13]。

3.3 温度

温度对酯化酶的催化效果也具有一定影响。温度与酯化酶本身基团的解离或者与底物的结合能力等具有一定相关性。据研究，酯化酶催化合成能力随温度升高而增强，但温度过高时，酯化酶活力逐渐下降并最终失活，如黑曲霉酯化催化的最适温度为30～36 ℃；红曲霉酯化酶催化作用的最适温度为30～40 ℃；伞状毛霉和卷枝毛霉酯化酶催化作用的最适温度为30 ℃；伯克霍尔德氏菌X10酯化酶催化作用的最适温度为35 ℃；伞枝犁头霉酯化酶催化作用的最适温度为34 ℃；葡萄球菌酯化酶催化作用的最适温度为37 ℃[12-16]。

3.4 pH

pH会对酯化酶的自身活性以及底物结构产生影响，从而影响酯化酶的催化能力。红曲霉酯化酶催化作用的最适pH为4.5～6.5；伞状毛霉酯化酶催化作用的最适pH为3.0；卷枝毛霉酯化酶催化作用的最适pH为3.5；伯克霍尔德氏菌X10酯化酶催化作用的最适 pH 为 6.5[11-15]。

3.5 外源物质

外源物质主要分为激活剂与抑制剂。葡萄糖可以作为速效碳源促进红曲霉产酯化酶能力；新鲜酵母破壁液对红曲霉产酯化酶具有诱导作用；乙醇与乳酸对酯化催化也具有促进效果；无水硫酸钠可以通过吸水作用，使酶促反应平衡向右，提高酯化催化活力。胡娜等[11]发现低浓度的乙酸乙酯对酯化酶酶活力具有抑制作用，而当其含量为30%时，对酶活力起促进作用；低浓度K+、Ca2+对酯化酶催化反应有促进作用，而 Fe2+、Na+、Mn2+、Mg2+、Li+、Zn2+对酯化酶催化反应有抑制作用；表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）等对酯化酶活力也具有抑制作用[11,16-17]。

4 酯化酶用于黄水处理的效益分析

（1）企业经济效益。黄水中添加酯化酶可大幅降低酿酒废水中COD含量，节省稀释用水费用，减少电力支出、设备损耗等，并一定程度上减少企业的排污费；同时酯化液可以用于二次发酵以及串蒸，减少制酒用曲量的同时提高酒的品质，增加收益。蒋学剑等[18]研究发现黄浆水用量40%、酒精度30%、己酸含量0.8%、酯化酶用量0.1%，每甑底锅串蒸酯化液用量20 L，优级品率、一级品率均提高35%；在公司中试车间推广使用黄水酯化液串蒸，每年可净增加效益456.75万元，达到了降低生产成本、增加经济效益的效果。

（2）酯化液的直接经济效益。刘宾等[19]研究表明，在乙醇体积含量为10%、己酸添加量1.5%、酯化酶用量7%、温度30 ℃的条件下酯化7 d，浓香型白酒中的主要香味物质——己酸乙酯的含量大幅度提升，由91.9 mg/L增加至2 746.6 mg/L，可以生产出以浓香型白酒主体香味物质为主的高质量酯化液。

（3）间接减少制酒成本。王晓丹等[20]利用1株从浓香型大曲中分离筛选得到的合成己酸乙酯能力较强的酯化酶生产菌——紫色红曲霉（Monascus purpureus）FBKL3.0018，对其产酯化酶条件进行了初步优化，确定该菌株较理想的发酵产酶条件，将该条件下所产的粗酶制剂用于浓香型大曲酒的生产，减少了用曲量，提高了原酒产量和质量。束成忠等[21]研究表明，酯化酶按投料量的0.5%加入，按原加曲量的10%减曲，每1 000 kg原料效益增加304.08元。若每天投入10.8 t原料，每月可多实现效益98 521.92元，全年按10个月计算，每年可增加效益985 219.20元。且发酵期按正常发酵进行生产试验，生产工艺不用改变，使用酯化酶，既提高了酒质，又降低了生产成本，带来可观的经济效益。

（4）环境生态效益。酯化酶应用于黄水中生成酯化液，通过对黄水中酸性成分的有效利用，对于企业而言得到直接的经济效益，此外还极大地减少了黄水对环境的危害，取得一定程度上的环境效益和社会效益。环境效益主要是利用酿酒副产物发酵可以使COD排放量得到控制，减少电力支出、设备损耗，减少人工支出，减少环境污染等。如刘子红等[22]的研究结果表明，科学利用黄水有效成分可以降低10%环保处理费用。社会效益主要是循环经济的利用，企业减少了大量的环境污染，树立负责任企业形象，提升品牌形象，实现了资源的循环利用与绿色经济发展。

5 展望

白酒酿造中酯化酶技术的应用是中国白酒工业的一项重大创新成果，该技术在浓香型白酒生产中的应用极大地提高了出酒率和优质酒率；突出了浓香型白酒己酸乙酯的主体香；酒体协调，促进了酯化反应；能够在较高的酸度下正常发酵，利于酒体“洁净”；较好地解决了酒质和出酒率的矛盾；有利于工艺稳定，提高生产效率；产酒醇甜，赋予成品酒良好的风味。

酯化酶使黄水酸性成分得到二次利用，降低酒厂废水的处理难度，提高酒的品质与出酒率，为企业产生直接的经济效益。该技术操作简单，在最优条件下酯化酶的催化反应具有较强的稳定性，且无需改变酿酒的生产工艺及设备，利于企业的推广。从经济效益、环境效益以及社会效益角度来看，酯化酶应用于酒厂黄水处理具有较好前景。

白酒生产过程中相关的因素很多，与白酒质量相关的因素也很多，所以在应用时一定要对酯化菌株及其性质和生产进行细致的研究。在实际生产中合理利用多种方法，加强产酯微生物的资源挖掘、酯化酶纯度提高、酒类酯类物质比例协调性调节及复合生物酯化酶制剂开发工作，以期进一步提高对黄水中酸性成分的利用，提高白酒品质。

目前的研究对新型高效的产酯化酶的菌株研究较少，且对菌株的最适产酯条件研究还不够系统完善，酯化酶商业化产品尚缺。应加强对高效产酯化酶菌株的研究，并对酯化酶的生产和保存技术进行研究，以推动其商业化进程。