山桐子叶际微生物群落多样性、结构及功能预测分析

2023-01-12周慧娜徐自恒薛晓焱王艳梅蔡齐飞耿晓东李明婉

经济林研究 2022年4期

周慧娜，张涛，徐自恒，薛晓焱，冯建，刘震，王艳梅，蔡齐飞，耿晓东，代莉，李明婉，李志

（1. 河南农业大学 a. 林学院；b. 中原地区森林资源培育国家林业局重点实验室，河南郑州 450002；2. 棕榈生态城镇发展股份有限公司，河南郑州 450000）

微生物是生态环境的重要组成部分，对生态环境的稳定发挥着重要作用，它们的生存繁衍影响着植株的健康生长。与土壤、根际相比，叶际微生物种类较少[1]，但仍发挥着关键的作用。叶际微生物（Phyllospheric microorganism）一般是指生活在植物地上部分，主要栖息于叶片的微生物群落[2]。对叶际微生物而言，叶际环境是一个非常苛刻且不稳定的生境，生活在叶表的微生物经常要面临水分和营养物质的不足，以及剧烈变化的强光、高温和高紫外线等的影响[1]，受当地环境影响明显[3-4]，即便如此，植物叶片仍存在大量不同性质的微生物，比如真菌、细菌和病毒等[5]。叶际微生物与植物体共同生长、相互依存、相互影响、相互制约，彼此形成一个紧密的整体，它们是微生物生态系统的主要成员，其代谢活动与代谢产物可以促进宿主适应环境，维持生态系统平衡[6]。其中，有可以固氮、促进宿主生长、抑制病原菌、降解农残农药等正面功能的有益菌，如苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis是一种常见的叶际细菌，作为生物杀虫剂，它在保护作物和防治病虫害方面起到了很大作用。由于长期使用同一类型的杀虫剂，昆虫易产生抗性[7]，而苏云金芽孢杆菌转基因作物的广泛应用，极大地减少了农药的使用，降低了环境污染，有助于生态系统的稳定性[8]。另一方面，也存在着引发病害、抑制植物生长等负面效应的病原菌[9]，如青枯假单胞菌Ralstonia solanacearum，俗称青枯菌，是危害严重的世界性植物病原细菌[10]，广泛分布于热带、亚热带、温带地区[11]，青枯菌可引起烟草、花生和番茄等萎蔫病，可侵染40多个科200多种植物，寄主范围极广[12]。目前，对于植物微生物的研究更多集中于土壤微生物、根际微生物以及微生物肥料等的研究[13-16]，相比之下，有关叶际微生物的研究相对较少。

山桐子Idesia polycarpaMaxim.，又名水冬瓜，为大风子科Flacourtiaceae山桐子属Idesia落叶乔木，分布广泛，树干通直美观，极具观赏价值[17]。山桐子果和种子均可榨油，干果含油率达35%左右[18]，木材质地松软，适宜做工艺品家具等[19]。油脂中亚油酸含量很高，山桐子果实中提取的油脂可以加工出优良的食油、柴油以及润滑油等，其油脂还可以通过加工用于制药，具有降低血脂、血压等功效[20]。由此可见，山桐子是一种有着观赏性、果材两用的多功能速生经济型树种[21]。目前，对于山桐子的研究，多集中于山桐子油、种子、果实以及栽培扦插等方面，对于山桐子微生物方面的研究尚不多见。微生物在自然环境中的相互作用非常复杂，它们的数量和多样性以及组成的异质性使其更加复杂化[22]。本研究通过分析健康与感病山桐子叶际微生物之间的群落多样性特征，探明微生物群落的主要差异，并对不同菌群进行功能预测分析，为山桐子科研及生产经营提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验地选在河南省郑州市金水区河南农业大学林学试验站，地理位置 113°38′E，34°47′N；海拔为108 m，该地区最高气温为43℃，最低气温为-17.9℃，年平均气温为14.2℃，年降水量为650.1 mm，无霜期为215 d，全年光照时间约为2 400 h，属于典型的半干旱半湿润大陆性季风气候。土壤为潮土，pH值为中性[23-24]。

1.2 样品采集

选择生长在郑州地区的山桐子为试验材料，株行距为4 m×4 m，山桐子采用常规栽培方法。分别采集健康与感病山桐子叶片，山桐子选择树体大小一致，且每株选择相同部位的叶片。将山桐子叶片清洗干净，用75%的酒精消毒4～5 min，用蒸馏水清洗3～4次；将处理过的叶片放在研钵中加入液氮进行捣碎处理，之后放入离心管中，应用CTAB方法提取DNA[25]。

1.3 高通量测序

使用上海派森诺生物科技有限公司Illumina平台对样品的16S rRNA和ITS基因测序。对细菌的16S V3V4区（测序策略：Novaseq-PE250）和真菌的ITS V1区（测序策略：测序策略：Miseq-PE250）进行测序。细菌的上游引物名称：338F上游引物序列：ACTCCTACGGGAGGCAGCA；下游引物名称：806R下游引物序列：GGA CTACHVGGGTWTCTAAT[26]。真菌的上游引物名称：ITS5F上游引物序列：GGAAGTAAAAG TCGTAACAAGG；下游引物名称：ITS1R下游引物序列：GCTGCGTTCTTCATCGATGC[27]。再将扩增产物用1.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物纯化效果，测定纯化后PCR产物的浓度，将纯化产物等摩尔数混合，以备上机前纯化和测序仪分析。

1.4 数据处理

运用QIIME软件（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0）进行序列过滤，以保证分析结果准确性。去除叶绿体来源和线粒体来源的序列。运用Mothur软件去除嵌合体序列，得到后续分析的优质序列。使用QIIME软件，对获得的序列按97%的序列相似度进行归并和OTU划分，获得每个OTU所对应的分类学信息，并使用QIIME软件计算多样性指数[28]。运用SPSS 26.0软件对健康山桐子与感病山桐子叶际微生物多样性指数进行显著性分析。采用PICRUSt2方法分析预测山桐子叶际菌群的代谢功能。

2 结果与分析

2.1 健康山桐子与感病山桐子叶际微生物的丰富度及多样性

健康（Y）与感病（BY）山桐子叶际细菌获得有效序列分别为211 375、202 030，真菌分别获得有效序列314 050、273 779（表1）。采用97%的序列相似度作为OTUs（Operational Taxonomic Unit，OTUs））的划分阈值。如图1所示，健康山桐子与感病山桐子细菌OTUs数量分别为212和198个，两者共有的OTUs数目为29个，特有OTUs数量分别为183和169个。健康山桐子与感病山桐子真菌OTUs数量分别为101和79个，两者共有的OTUs数目为31个，特有OTUs数量分别为70和48个。

表1 样品序列信息Table 1 Sample sequence information

分析正常山桐子叶片与感病山桐子叶片的Chao1、Observed_species、Pielou_e、Shannon 和Simpson多样性指数（表2），发现山桐子健康叶片细菌及真菌的丰富度和多样性均高于感病叶片，说明山桐子感病在一定程度上降低了其丰度和多样性，且Chao1指数的显著差异表明健康山桐子叶际细菌丰富度显著高于病叶（P＜0.05）。

2.2 健康山桐子与感病山桐子叶际细菌群落组成

测序结果表明，山桐子叶际细菌隶属于16个门、43个纲、90个目、143个科、199个属。如图2A，在门水平上，山桐子叶际细菌主要为变形菌门Proteobacteria。隶属于该门的细菌丰度分别占健康和感病植株的77.66%和70.29%。变形菌门Proteobacteria、蓝细菌门Cyanobacteria、酸杆菌门Acidobacteria相对丰度相比健康植株，感病植株中相对丰度均有所下降；相比健康植株，厚壁菌门Firmicutes、放线菌门Actinobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、绿弯菌门Chloroflexi相对丰度在感病植株中均有所增加。

图1 山桐子叶际细菌、真菌韦恩图Fig. 1 Venn diagram of bacteria and fungi in leaf area of I. polycarpa

表2 样品微生物多样性指数Table 2 Microbial diversity index of samples

在叶际细菌属水平上（图2B），不动杆菌属Acinetobacter和别生根瘤菌-新生根瘤菌-寄生根瘤菌-根瘤菌属Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium的相对丰度较高，不动杆菌属在健康和感病植株中相对丰度分别为32.67%和24.90%，别生根瘤菌-新生根瘤菌-寄生根瘤菌-根瘤菌属在两者中相对丰度分别为11.64%和8.47%，这两个属以及伯克霍尔德氏菌属Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、短波单胞菌属Brevundimonas在感病植株的相对丰度相对于健康植株均有所下降，Escherichia-Shigella属感病植株的相对丰度相较于健康植株上升较多（1.14%、5.46%）。

检测出健康山桐子叶际细菌特有菌属92类，除去未分类及未培养菌属，特有菌属相对丰度排名前三的是：Candidatus_Competibacter、水杆菌属Aquabacterium以及海洋芽胞杆菌属Oceanobacillus；感病山桐子叶际特有细菌菌属56类，除去未分类及未培养菌属，相对丰度排名前三的是动球菌属Kineococcus、脆弱球菌属Craurococcus及薄层菌属Hymenobacter。

2.3 健康山桐子与感病山桐子的叶际真菌组成分析

测序结果表明，山桐子叶际真菌隶属于8个门、18个纲、37个目、71个科、101个属。如图3A，在门水平上，山桐子叶际真菌优势菌落为子囊菌门Ascomycota、担子菌门Basidiomycota，分别占健康和感病植株的85.15%和93.54%。其中子囊菌门Ascomycota的分别占健康和感病植株77.59%和89.50%，是相对丰度最高的门。经分析，担子菌门Basidiomycota在正常植株（7.56%）是感病植株（4.04%）的1.9倍，斜纹菌门Olpidiomycota在正常植株（5.34%）是感病植株（1.83%）的2.9倍，毛霉菌门Mucoromycota在健康植株（1.50%）是感病植株（0.65%）的2.3倍，三者相比，健康植株，感病植株的相对丰度都大幅降低。

在属水平上（图3B），健康植株中链格孢属Alternaria、亚隔孢壳属Didymella相对丰度均在15%以上，链格孢属Alternaria在感病植株中相对丰度占一半以上，是感病植株的主要菌属。相对丰度前十的菌属里，亚隔孢壳属Didymella（15.43%，8.95%）、油壶菌属Olpidium（5.34%，1.83%）、球腔菌属Mycosphaerella（4.57%，1.05%）健康植株高于感病植株，链格孢属Alternaria在感病叶片里明显增多，其余菌属差异不大。

图2 健康山桐子与感病山桐子主要细菌群在门（A）、属（B）水平上相对丰度Fig. 2 Relative abundance of the main bacterial groups at phylum (A) and genus (B) levels of healthy and susceptible I. polycarpa

图3 健康山桐子与感病山桐子主要真菌群在门（A）、属（B）水平上相对丰度Fig. 3 The relative abundance of the main fungi in healthy and susceptible I. polycarpa at phylum (A) and genus (B) levels

2.3.1 链格孢属Alternaria

链格孢属Alternaria是一类世界范围广泛分布的真菌，存在于自然界的不同基质上，可作为腐生菌、寄生菌和内生菌。作为腐生菌，链格孢以极强的适应能力存活于水、土壤、空气和纸等不同基质上，部分可在已发病的寄主组织上再次定植，占领其他病原物造成的病斑位点、受损部位或其他衰弱组织等，加重其他病害的发生。链格孢属病叶相比健康叶片增加了215%，推测该属为叶片致病的主要菌属。

2.3.2 亚隔孢壳属Didymella

亚隔孢属真菌是一类重要的植物病害病原菌。徐兵划等[29]研究报道亚隔孢壳属真菌Didymella.bryoniae（Auersw.）可引起蔓枯病，危害甜瓜、黄瓜、哈密瓜、西瓜、西葫芦等至少12个属，23种葫芦科作物。亚隔孢壳属Didymella是唯一与茎点霉属和壳二孢属真菌正确关联的有性型属[30]，茎点霉属由Fries（1821）建立，该属真菌是一类重要的植物病原菌，分布广泛且具有丰富的多样性,主要引起植物叶片及茎杆上的病斑，可导致作物产量严重损失，其中一些物种还被列为检疫性真菌[31]。山桐子病叶中亚隔孢壳属数量相较于健康叶片降低了42%。

2.3.3 油壶菌属Olpidium

油壶菌属Olpidium是壶菌目Chytridiales中的一种生物内生的、整体产果式真菌。其中Olpidium uicia可引起蚕豆瘿病，是蚕豆主要和最具破坏性的疾病[32]。该属相对于健康叶片，病叶中相对丰度下降了66%。

2.3.4 健康山桐子和感病山桐子叶际真菌特有属

检测出健康山桐子叶际真菌特有菌属34类，除去未分类及未培养菌属，特有菌属相对丰度排名前三的是：赤霉菌属Gibberella、毛壳菌属Chaetomium及拟棘壳孢属Pyrenochaetopsis；感病山桐子叶际特有菌属29类，除去未分类及未培养菌属，特有菌属相对丰度排名前三的是：热子囊菌属Thermoascus、黄丝曲霉属Talaromyces及裸脚菇属Gymnopus。

2.4 山桐子叶际微生物群落功能预测分析

2.4.1 细菌群落

基于KEGG数据库对细菌群落进行分析（图4），结果表明在第一层级水平，有生物进程（Cellular Processes）、环境信息处理（Environmental Information Processing）、遗传信息处理（Genetic Information Processing）、人类疾病（Human Diseases）、代谢（Metabolism）和有机体系统（Organismal Systems）6种代谢通路。其中和代谢有关的基因相对丰度最高，为81.34%。

图4 PICRUSt2预测细菌群落的功能（level2）Fig. 4 Bacterial communities functions predicted by PICRUSt2 (level2)

在KEGG第二层级上研究代谢功能，丰度排名位于前三的代谢功能有辅助因子和维生素的代谢（Metabolism of cofactors and vitamins）、氨基酸代谢（aminoacid metabolism）和碳水化合物代谢（carbohydrate metabolism），其丰度分别为16.57%、12.02%和11.63%。同时，还存在能量代谢（energy metabolism）、其他氨基酸代谢（Metabolism of other amino acids）、萜类化合物和聚酮类化合物的代谢（Metabolism of terpenoids and polyketides）、异源生物降解和代谢（xenobiotics biodegradation and metabolism）、脂代谢（lipid metabolism）、其他次生代谢产物的合成（biosynthesis of other secondary metabolites）、聚糖生物合成与代谢（glycan biosynthesis and metabolism）、核苷酸代谢（nucleotide metabolism）、折叠，分类和降解（Folding,sorting and degradation）、复制和修复（replication and repair）、翻译（translation）等。

2.4.2 真菌群落

基于MetaCyc数据库对真菌群落进行分析（图5），在山桐子叶际真菌群落有5个代谢通路，分别为：生物合成（Biosynthesis）、退化/利用/同化（Degradation/Utilization/Assimilation）、前体代谢物和能量的产生（Generation of Precursor Metabolite and Energy）、聚糖通路（Glycan Pathways）和代谢集群（Metabolic Clusters）。主要功能类群为生物合成（44.74%）、前体代谢物和能量的产生（35.57%）。

图5 PICRUSt2预测真菌群落的功能（level2）Fig. 5 Fungal communities functions predicted by PICRUSt2 (level2)

在第二层级上，主要功能有核苷和核苷酸的生物合成（Nucleoside and Nucleotide Biosynthesis）、辅因子，辅基，电子载体和维生素生物合成（Cofactor, Prosthetic Group, Electron Carrier, and Vitamin Biosynthesis）、氨基酸生物合成（Amino Acid Biosynthesis）、电子转移（Electron Transfer）和呼吸（Respiration）。

3 讨论

在本研究中，发现山桐子健康叶片细菌及真菌丰富度和多样性均高于感病叶片，说明山桐子感病在一定程度上降低了其丰度和多样性，与前人研究[33-35]得出健康植株比感病植株拥有更高的丰富度和多样性的结论一致。叶际细菌中变形菌门Proteobacteria、拟杆菌门Bacteriodetes等为最具代表性的优势类群，不动杆菌属Acinetobacter、假单胞菌属Pseudomonas等在不同植物叶际中也被反复检测到；门水平上的子囊菌门Ascomycota、担子菌门Basidiomycota是叶际真菌的优势类群，属水平上枝孢属Cladosporium、链格孢属Alternaria等较为常见[36]。对比两者之间的差异性发现链格孢属Alternaria真菌在健康山桐子的相对丰度远低于感病山桐子的相对丰度。链格孢属Alternaria属于子囊菌门、座囊菌纲、格孢腔目和孢腔菌科[37]，对应健康山桐子与感病山桐子的叶际真菌优势门、纲、目、科，因此可能是由于链格孢属Alternaria在健康山桐子与感病山桐子中的显著性差异导致了山桐子感病。链格孢属Alternaria真菌同时具有寄生和腐生性，可以适应多种不同的环境条件，故繁殖能力较强[38]。它们分泌的酶可以降解寄主植物的保护组织，降低植株抵御病原体的能力，帮助病原体入侵、定植植物[39]，造成多种植物感病[40]。

亚隔孢壳属Didymella、油壶菌属Olpidium、球腔菌属Mycosphaerella真菌感病植株相较于健康植株相对丰度都出现不同程度下降，由此推测，链格孢属真菌的增长抑制了上述菌群的生存和繁殖。在冯丽等[41]的研究中，深海沉积物中分离出的包括链格孢属在内的几个属对多种指示细菌均产生了不同程度的抑制。因此，感病山桐子叶际细菌中除叶绿体线粒体以外的几个菌落相对丰度降低可能也与链格孢属菌落的抑制作用有关。

通过PICRUSt2功能预测，与代谢、生物合成及能量产生有关的微生物群落活跃度较高。其中，辅助因子和维生素的代谢在细菌群落中活跃度最高，其在维持细胞正常生长和正常代谢，维持机体正常生命活动中不可或缺。真菌群落内核苷和核苷酸的生物合成功能群丰度最高，它们是生物体内核酸的重要组成部分，参与多种代谢和调节活动。

本研究基于高通量测序对健康山桐子与感病山桐子的叶际细菌和叶际真菌群落多样性、组成及功能预测进行了研究，其中健康山桐子与感病山桐子的叶际细菌群落多样性指数总体来说差异不显著，但一些丰度较低的菌属在健康山桐子与感病山桐子之间有明显差异，如短波单胞菌属Brevundimonas在健康植株（2.08%）是感病植株（0.74%）的2.8倍，这说明了虽然叶际细菌群落多样性指数无显著差异，但是两者之间的群落组成仍存在差异[42]。还有一些相对丰度不高的微生物菌落，不代表其在植物中没有作用或作用微弱，在某些情况下它们是影响植物多种生理功能的主要因素[43]，其对植物的影响还有待进一步探究。

微生物群落相互之间以及与环境之间息息相关、互相作用[44-46]，本文重点关注优势菌落对山桐子产生的影响，后续将对可能产生关键作用的非优势菌落，以及菌落之间联合效应对山桐子的作用进行深入分析，以期为山桐子更好地生长发育提供参考依据。