莽吉柿果壳不同萃取物中总黄酮、总酚含量及抗菌活性

林月乔，张子桦，续文丽，李楠，刘辉，陈鑫*

佛山科学技术学院医学院（佛山 528000）

莽吉柿（Garcinia mangostana L.）属藤黄科藤黄属植物，别名山竹、倒捻子，主要分布于泰国、马来西亚和印度尼西亚等东南亚国家，我国台湾、云南和广东等省有引种。莽吉柿不仅富含营养，其果壳还具有广泛的药用价值。在东南亚国家，果皮可用于煲汤或泡茶，用于治疗淋病、腹泻、口疮等[1]。晾干并碾磨后的果壳可作为传统药物，常用于治疗腹痛、感染性创伤、慢性溃疡等疾病[2]。目前研究已发现，莽吉柿果壳具有强大的抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒及抗菌等药理活性，其化学成分主要包括黄酮、多酚[3]、氧杂蒽酮等[1]。

目前，对莽吉柿果壳的研究主要集中在总黄酮、总酚提取工艺和抗氧化活性。关于其不同极性有机溶剂萃取部位的研究及抑菌活性鲜有报道。本研究采用三氯化铝分光光度法和福林酚法对莽吉柿果壳不同溶剂萃取物中总黄酮、总酚含量进行测定，并采用纸片扩散法和微量肉汤稀释法对院内感染的主要细菌种类进行抑菌活性评价，为莽吉柿的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

莽吉柿（市售）；芦丁对照品、没食子酸对照品（纯度均＞98%，成都德斯特生物技术有限公司）；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、无水乙醇、氢氧化钠、碳酸钠（广州化学试剂厂）；亚硝酸钠、氯化钠、硝酸铝、福林酚（上海麦克林生化科技有限公司）；有机溶剂（均为国产分析纯）；胰蛋白胨、牛肉浸膏。

菌株：大肠杆菌（E.coli）、金黄色葡萄球菌（S.aureus）、肺炎克雷伯菌（K.pneumoniae）、铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）、鲍曼不动杆菌（A.baumannii）（佛山市中医院检验科）。

JJ500电子天平、JJ224BC万分之一分析天平（常熟市双杰测试仪厂）；岛津UV-2700紫外分光光度计（日本岛津公司）；YRE-2000B旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限责任公司）；CSH-ZY-00032锐思捷纯水系统（厦门锐思捷水纯化技术有限公司）；GR-85DA高压灭菌锅（美国致微）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备

取300 g干燥莽吉柿果壳，碾磨后用8倍量的95%乙醇回流提取2次，减压浓缩得到醇提取物，经水混悬后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，分别减压回收溶剂，干燥至恒重，得到石油醚萃取物（1.322 g）、氯仿萃取物（1.785 g）、乙酸乙酯萃取物（3.562 g）和水层（6.264 g）。

1.2.2 总黄酮含量测定

采用三氯化铝分光光度法[4]。精密称取12.5 mg芦丁标准品于50 mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，得到质量浓度0.25 mg/mL的标准溶液。使用移液管移取0，0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mL配制好的标准品溶液分别置于10 mL容量瓶中，分别依次加入2.5，2.0，1.5，1.0，0.5和0 mL的无水乙醇，依次加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，混匀后放置6 min，加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，混匀后放置6 min，加入4 mL 10%氢氧化钠溶液，混匀后放置6 min，加入80%乙醇溶液定容至刻度，摇匀放置15 min。用紫外分光光度仪在510 nm波长处测定吸光度，制作标准曲线，得回归方程y=1.169 6x-0.014 3，R2=0.999 3。样品中黄酮测定按上述方法。总黄酮含量以每1 g干萃取物中毫克芦丁当量（rutin equivalents，RE）表示（mg RE/g）。

1.2.3 总酚含量测定

采用福林酚比色法[5]。精密称量1 mg没食子酸标准品于10 mL容量瓶中，用75%乙醇定容至刻度，得到浓度0.1 mg/mL的标准溶液。精密移取0，0.1，0.3，0.5，0.7和0.9 mL标准溶液于10 mL容量瓶中，分别依次加入1.0，0.9，0.7，0.5，0.3和0.1 mL的75%乙醇，再依次加入6 mL超纯水、0.5 mL福林酚试剂、1.5 mL 20%碳酸钠溶液，加入超纯水定容至刻度，混匀静置30 min。用紫外分光光度仪在720 nm波长处测定吸光度，制作标准曲线，得回归方程y=12.403x+0.036 3，R2=0.999 7。样品中总酚测定按上述方法，总酚含量以每1 g干萃取物中毫克没食子酸当量（gallic acid equivalents，GAE）表示（mg GAE/g）。

1.2.4 抑菌活性测试

1.2.4.1 营养肉汤（nutrient broth，NB）培养基的制备

取10 g胰蛋白胨、5 g氯化钠、3 g牛肉浸膏加入1 000 mL无菌蒸馏水中，水浴加热搅拌至完全溶解后，置于高压蒸汽灭菌锅中，于121 ℃高压灭菌15 min，密封后放入4 ℃冰箱保存备用。

1.2.4.2 菌株复苏及传代

菌种的复苏：鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌菌株从-80℃冰箱中取回，并分别在超净台中采用四区划线法接种于固体培养基上，后将培养基放置于37 ℃的细菌培养箱培养24 h，进行菌种复苏。

菌种的传代：取出上述已复苏好的细菌培养基，在超净台中轻轻蘸取某一单菌落，在另一新的固体培养基中采用四区划线法进行划线接种，划线完毕后将放置于37 ℃的细菌培养箱倒置培养24 h。

1.2.4.3 菌悬液的制备

根据文献[6]，略作修改。取平板中新鲜培养的经过连续传代后的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌各两株，分别刮取少量菌落，用营养肉汤液体培养基稀释成0.5个麦氏浊度（1.5×108CFU/mL）菌液，再用NB液体培养基按1∶1 000稀释。

1.2.4.4 药敏纸片的制备

先制备试验药品，分别称取5 g不同萃取物，灭菌水溶解后调整药物浓度为100 mg/mL。后将直径为5 mm的灭菌空白纸片放入无菌的药敏瓶中，分别加入配制好的药物溶液，浸泡12 h后烘干备用。

1.2.4.5 纸片扩散法（K-B）法测定抑菌作用

取新鲜菌液配制成0.5个麦氏浊度，取适量菌悬液均匀涂布于琼脂培养基，反复3次。取含有不同萃取物的药敏纸片分别贴于固体培养基的表面，阳性对照取商品化的庆大霉素（10 IU/片），于37 ℃恒温培养16～20 h，使用游标卡尺精准测量菌落的直径，试验重复3次，取平均值。

1.2.4.6 最小抑菌浓度（MIC）的测定

采用微量肉汤稀释结合96孔板培养法测定MIC[7]。取96孔板，标记好药物提取液名称，并且将第11孔以及第12孔设置为“菌阳性对照组”、“培养基空白对照组”。第1排的第一个孔加入200 μL 1.6 mg/mL的提取液，从第2孔开始每孔加入100 μL营养肉汤培养基，用排枪从第1孔中取100 μL提取液至第2孔，反复抽放、混匀，按上述步骤依次完成至第10孔，弃去100 μL，完成药液的倍比稀释。从第1排至第11排每孔依次加入100 μL 0.5个麦氏浊度稀释1 000倍的菌液，第12孔中补充100 μL 营养肉汤培养基，最终每孔内液体体积应为200 μL，后置于培养箱37 ℃恒温培养16～20 h。结果的判定：在标记为“+”的孔有细菌生长且标记为“-”的孔澄清的前提下，最后一个澄清、没有细菌生长的孔的药物浓度即最小抑菌浓度MIC。

1.2.4.7 最低杀菌浓度（MBC）的判定

依次将没有肉眼可见的细菌生长的各孔取适量液体均匀涂布于琼脂固体平板上，于37 ℃恒温培养16～20 h，观察是否有细菌生长，若平板上菌落数少于 5个，即以其最小药液浓度作为最低杀菌浓度（MBC）。

1.3 数据处理

所有试验均平行操作3次，试验结果均表示为“平均值±标准偏差”。数据采用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析，采用ANOVA进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 莽吉柿果壳不同溶剂萃取物中总黄酮和总酚含量

由表1可知，莽吉柿果壳4种不同溶剂萃取物中均含有总黄酮和总酚，总黄酮含量为乙酸乙酯＞水＞氯仿＞石油醚，总酚含量为乙酸乙酯＞石油醚＞氯仿＞水。乙酸乙酯萃取物中总黄酮和总酚的含量最高，与其他各组具有显著性差异（P＜0.001）。石油醚和氯仿中总黄酮和总酚的含量均较低，其中总酚含量比较接近。水层中总酚含量最低。所测得总黄酮和总酚含量均高于祝思宇等[3]测定山竹果壳中的含量，提示不同极性溶剂萃取是富集总黄酮和总酚的有效方法。

表1 莽吉柿果壳不同溶剂萃取物总黄酮和总酚含量（平均值±标准差）

2.2 莽吉柿果壳不同溶剂萃取物对试验菌的抑菌效果

2.2.1 K-B纸片扩散法试验

由表2可知，莽吉柿果壳不同溶剂萃取物对不同试验菌的抑菌作用差异较大，其中乙酸乙酯萃取物和水层的活性最佳，对5种试验菌的抑菌圈直径基本都大于15 mm，表现为高度敏感或极度敏感，其中金黄色葡萄球菌的抑菌圈24.3±0.15 mm/23.8±0.19 mm，甚至大于阳性对照药物庆大霉素（10 IU/片）21.3±0.17 mm。石油醚和氯仿萃取物仅对金黄色葡萄球菌有明显抗菌活性，抑菌圈直径均超过20 mm，且优于阳性对照药物庆大霉素，表现为极度敏感，对其余4种受试菌抑菌圈均不明显，表现为低敏。

2.2.2 MIC值和MBC值的测定

由表3和表4可知，莽吉柿果壳不同溶剂萃取物对5种不同试验菌的MIC值、MBC值与纸片扩散法的结果基本一致，乙酸乙酯萃取物和水层对5种菌都表现出很好的抗菌活性，其中对金黄色葡萄球菌活性最好，MIC值均为0.125 mg/mL，MBC值均为0.25 mg/mL，对大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌的MIC值均在0.5～2 mg/mL，MBC值均在1～4 mg/mL。石油醚和氯仿萃取物仅对金黄色葡萄球菌有明显抗菌活性，MIC值分别为0.5和0.25 mg/mL对其他4种试验菌MIC均为8 mg/mL。李武超等[8]研究表明山竹果皮总黄酮对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、假单胞菌的抑菌圈分别为10.20，14.20，15.37和15.97 mm。Cunha等研究发现，与氨苄西林相比，山竹乙醇提取物抗菌活性更高，MIC值在1～10 g/L，同时细菌耐药性更低[9]。Janardhanan等[10]研究山竹果皮氯仿提取物对致龋菌的影响，MIC值最低的是嗜酸乳杆菌（MIC 25 mg/mL）。试验结果与上述研究一致，但经不同溶剂萃取后作用强于总提取物。

表3 莽吉柿果壳不同溶剂萃取物对试验菌的MIC

表4 莽吉柿果壳同溶剂萃取物对试验菌的MBC

3 结论

此次研究测定了莽吉柿果壳提取物的不同溶剂萃取物总黄酮、总酚的含量，并检测了各个部位对引起院内感染的主要细菌大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的抑菌作用。结果显示，各萃取物中总黄酮的含量为乙酸乙酯＞水＞氯仿＞石油醚。总酚含量为乙酸乙酯＞石油醚＞氯仿＞水。乙酸乙酯萃取物中总黄酮和总酚的含量最高，水层中总黄酮含量高于石油醚和水层，而总酚含量最低。乙酸乙酯萃取物和水层对5种菌均具有较好的活性，其中金黄色葡萄球菌活性最佳，MIC均为0.125 mg/mL，抑菌圈优于阳性对照药物庆大霉素，该菌株对这2种萃取物变表现为极度敏感，其他4种菌则表现为高度敏感。石油醚和氯仿萃取物仅对金黄色葡萄球菌有明显抑菌活性，对其他4种菌株抑菌作用均不明显。多项研究表明黄酮类成分具有较好的抗菌作用[8-11]。试验结果显示抗菌活性与总黄酮含量呈正相关，提示抗菌活性可能与总黄酮含量有关，因此认为莽吉柿果壳中抗菌的活性成分集中在乙酸乙酯部位。