燕麦配方对酪氨酸酶活性及黑色素抑制作用

木其尔，陈希民，陈月晓*

1.北京市营养源研究所（北京 100069）；2.北京市科学技术研究院（北京 100089）

随着年龄增长，色素沉积、肤色暗黄等皮肤症状为东方女性追求美丽过程中越来越重视的问题。黑色素的代谢在肤色改善中发挥着重要作用[1]。目前曲酸[2]、维生素C[3-4]、亚油酸[5]等酸性成分是抑制黑色素形成的主要功效物质，但具有溶解性差、配伍性差及不稳定等缺点。而天然植物提取物，如洋甘菊提取物、甘草提取物、熊果苷[6-8]等，具有安全性高、刺激性小、疗效显著等优点，但易受使用剂量较小、皮肤屏障渗透吸收利用率低等因素的影响。

研究表明，燕麦中含有丰富的酚酸、类黄酮等化合物，具有较好的抗氧化功效[9-10]；燕麦生物碱提取物具有抗组胺和抗炎活性[11-12]，其美白功效研究却鲜有报导。传统中药中具有美白功效的中药材薏苡仁、茯苓、山药、白芸豆均被纳入国家卫健委食品安全标准与检测评估司发布的《按照传统既是食品优势中药材的物质目录管理规定》中。烟酰胺在临床中具有抑制黑色素、加快皮肤细胞代谢以实现改善肤质的效果[13]。此次试验选择燕麦、椰粉、药食同源原料及烟酰胺锌作为品牌A即食麦片配方基础，通过体外酪氨酸酶抑制实验研究其对酪氨酸酶活性抑制的作用及黑色素抑制作用，并探索配方中燕麦、椰粉、烟酰胺锌成分的酪氨酸酶活性抑制及黑色素抑制效果，为产品研发提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

品牌A即食麦片（桂格5白混合即食麦片，主要原料包括燕麦、椰子粉、烟酰胺、药食同源原料、锌等）；燕麦片、椰子粉、烟酰胺锌、燕麦椰子粉组合，均由百事亚洲研发中心有限公司提供。

蒸馏水（符合GB/T 6682—2016《分析实验室用水规格和试验方法》规定的一级水）；磷酸盐缓冲液（PBS，pH 6.8，0.1 mol/L）；L-酪氨酸（分析纯，T3754，纯度＞98%，Sigma公司）；酪氨酸酶（T3824，1 000 U/mg，Sigma公司）；曲酸（S30151，上海源叶生物科技有限公司）。

1.2 主要仪器与设备

ME235s电子天平（德国赛多利斯公司）；ML204T电子天平[梅特勒托利多仪器（上海）有限公司]；DH-101-3BS电热恒温箱（天津市中环实验电路有限公司）；KQ-500DE超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；BioTek F4酶标仪（美国宝特公司）；-80 ℃超低温冰箱（冠森生物科技上海公司）；96孔酶标板[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；NT-6L纳米研磨机（无锡市少宏粉体科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 溶液配制

称取0.025g L-酪氨酸，使用PBS缓冲液溶解，超声助溶5 min，定容至50 mL，得到L-酪氨酸溶液。

称取2.5 mg酪氨酸酶，用PBS溶液定容至5 mL，于-20 ℃保存。

称取40 mg曲酸，用PBS溶液定容至1 L，制备成0.040 g/L曲酸标准溶液，用PBS溶液逐级梯度稀释，最终制备成0.040，0.020，0.010，0.008，0.005和0.002 g/L标准溶液。

1.3.2 样本处理

燕麦片、椰子粉、燕麦椰子粉组合、品牌A即食麦片分别使用纳米研磨机研碎。

分别称取70.71 mg燕麦片、9.3 mg椰子粉、79.45 mg燕麦椰子组合、100 mg品牌A即食麦片的研磨粉于10 mL容量瓶中，分别加入PBS溶液，37 ℃恒温条件下超声30 min，并定容至10 mL，转移至15 mL离心管中，旋涡离心5 min，制备混悬液待测。

称取0.05 mg烟酰胺锌，溶于1 000 mL PBS溶液中，混匀待测。

0.025g L-酪氨酸，使用PBS缓冲液溶解，超声助溶5 min，定容至50 mL，得到L-酪氨酸溶液。

1.3.3 试验分组

在96孔酶标板中设置溶剂本底孔（编号Ta）、溶剂反应孔（编号Tb）、样品本底孔（编号Tc）、样品反应孔（编号Td）。其中：Ta组为溶剂本底组，不加底物L-酪氨酸溶液、不加样品溶液；Tb组为溶剂反应组，加底物L-酪氨酸溶液但不加样品溶液；Tc组为样品本底组，不加底物L-酪氨酸溶液、加样品溶液；Td组为样品反应组，既加底物L-酪氨酸溶液又加样品溶液。每组做3个平行。

1.3.4 试验检测

根据表1，在1.5 mL离心管中依次加入相应体积的PBS溶液、酪氨酸酶及5种样品混悬液，同时按照1.3.1的剂量设定曲酸溶液阳性对照组和除样品外的空白对照组，每样设置3个平行。振荡混匀后，于37 ℃恒温箱中孵育10 min，每孔加入49 μL酪氨酸酶溶液，混匀，于37 ℃恒温箱中孵育5 min，在-4 ℃冷冻离心机中以20 000 r/min离心5 min，每样取10 μL添加于96孔酶标板中，酶标仪检测每孔吸光度（A），检测波长设定为475 nm。

表1 酪氨酸酶活性抑制试验加样表

1.3.5 结果计算

酪氨酸酶活性抑制率按式（1）计算。

式中：Y为酪氨酸酶活性抑制率；Ad为样品反应孔吸光度；Ac为样品本底孔吸光度；Ab为溶剂反应孔吸光度平均值；Aa为溶剂本底孔吸光度平均值。

1.3.6 曲酸标准曲线

以曲酸的浓度为横坐标，其对应的酪氨酸酶抑制率为纵坐标，绘制曲线，拟合得到回归方程（R2≥0.9）。根据回归方程，计算酪氨酸酶抑制率为50%时对应的曲酸浓度，即为曲酸的IC50值。

1.4 统计学方法

试验每样设置3个平行，数据采用Excel（2016 MSO）表格进行整理，并采用SPSS（version 18.0，IBM）软件分析处理，采用ANOVA检验5种检测样品酪氨酸抑制率的差别，双侧P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 曲酸标准曲线绘制结果

结果（表2和图1）显示，酪氨酸酶抑制率与曲酸浓度呈正相关关系，在浓度0.002～0.010 g/L之间酪氨酸酶抑制率增加幅度较高，而随着浓度逐渐增加，曲酸对酪氨酸酶的抑制效果趋于平缓，最终在浓度0.04 g/L时达到87.255%。计算酪氨酸酶抑制率50%时，曲酸的对应浓度（IC50）为0.014 6 g/L，处于0.005～0.030 g/L范围内，证明试验检测系统有效。

图1 曲酸酪氨酸酶抑制率标准曲线

表2 曲酸标准浓度及对应的抑制率

2.2 样品酪氨酸酶抑制率检测结果

酪氨酸酶抑制率检测结果显示（图2），燕麦、椰粉及烟酰胺单独使用酪氨酸酶抑制率分别为11.62%，8.44%和1.54%。燕麦椰粉组合使用酪氨酸酶抑制率为23.93%，显著高于燕麦和椰粉单独使用抑制率（P＜0.05），且呈现一定协同作用；品牌A即食麦片酪氨酸酶抑制率为23.79%，与燕麦椰粉组合使用抑制效果一致，说明在品牌A即食麦片发挥主要作用的为燕麦和椰粉2种成分，这可能与复配产品中燕麦和椰粉成分总体占比较高有关。

图2 5种样品酪氨酸酶抑制率检测结果

3 讨论

曲酸是从曲霉真菌中分离出来的次生代谢产物，临床上主要用于减轻色素和皮肤脱色[14]，对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶活性均具有较强的抑制作用，且呈现较好的量效反应关系，被证实最适合作为阳性对照的化合物[15]，在国内外体美白成分试验研究[16-17]中均被广泛应用。试验中，曲酸的IC50为0.014 6 g/L，与其他相关研究结果一致[18]，表明试验采用曲酸作为阳性对照结果可靠。

L-酪氨酸氧化是黑色素合成的起始步骤，酪氨酸酶是定位在黑色素小体膜上的糖蛋白，是研究黑色素异常沉积的分子靶标[19]。黑色素在细胞黑素小体的合成过程受酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相关蛋白1（TYRP1）和l酪氨酸酶相关蛋白2（TYRP2）的调控，其中酪氨酸酶TYR和TYRP2是影响黑色素数量和质量的关键限速酶[20]，能够催化L-酪氨酸羟基化为L-多巴醌（DQ），是黑色素合成的限速步骤[21]。酪氨酸酶的过量表达与黑色素的沉积等的发生有密不可分的关系[22-23]。当酪氨酸酶过量表达时，黑色素过度沉积而形成皮肤色斑，而酪氨酸酶表达不足则会引起白化病、白癜风等疾病[24]。而细胞氧化应激状态下，皮肤表皮细胞内巯基氧化失去抑制TYR能力，也会导致黑色素的合成量增加[25]。一般来说不同肤色黑色素细胞中的酪氨酸酶表达量无明显差异[26]，对酪氨酸酶进行活性调节成为影响黑色素合成的关键所在。在既往研究中，对氨酸酶的活性研究大多局限于中药或提取物，但普通食物对酪氨酸酶的活性研究较少。

燕麦中多酚可抑制角质形成细胞中核因子Kappa B的活性和组胺释放，减少皮肤皱纹，保护表皮细胞DNA免受包括紫外线照射在内的环境损害[27]。与此同时，燕麦中的β-葡聚糖上调钙敏感受体（CaSR）的表达，增加细胞外钙离子的敏感性，共同诱导角质形成细胞分化和神经酰胺合成[28]。椰肉中L-精氨酸及多酚化合物对超氧阴离子自由基、DPPH·自由基和羟基自由基均有较强的清除能力[29]。椰油通过降低细胞内ROS水平及提高细胞内超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT和谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px活性，起到保护细胞氧化应激损伤的作用[30-31]。尽管试验原料，如燕麦和椰子粉中含有这些活性物质，但鲜有针对燕麦、椰子粉与酪氨酸酶直接作用的研究。

与此同时，依据该产品的配料信息，除燕麦椰子粉等，也含有一些药食同源的传统食材，如薏苡仁、山药、茯苓等。药食同源植物兼具营养价值及药用价值，在普通食品、药品及功能食品领域中被广泛研究应用，其中薏苡仁、山药、茯苓及白芸豆作为传统美白方剂如七白散、三白汤等的要药，在增白祛斑等皮肤改善过程中发挥重要作用。现代研究发现：薏苡仁可有效降低中波紫外线照射后人体HSF细胞中基质金属蛋白酶1,3 mRNA表达，抵抗皮肤光老化[32]；山药中山药多糖和山药皂苷促进人体成纤维细胞WS1分泌胶原，对移植性黑色素B16细胞增殖及黑色素形成具有很强的抑制作用[33]；茯苓抑制皮肤酪氨酸酶mRNA并提高皮肤转化生长因子β-1和抗氧化蛋白的表达[34]。

随着人们健康要求的提高，通过摄取的食品来调整机体的生理机能达到健康状态替代对食品的感官单一要求。抑制黑色素形成和美白产品的研发思路主要以酪氨酸酶抑制剂为主，通过抑制酪氨酸酶活性和调节酪氨酸酶的转录作为美白添加剂的作用靶点，且研发多局限于护肤品范围内，因此对具有抑制黑色素形成和美白功效的食品提出新的研发需求。配方在燕麦、椰子粉等可直接入食产品基础上，添加烟酰胺锌，并合理搭配药食同源目录中具有美白功效的原料，拟通过食用方式达到改善皮肤状态的目的。经检测，配方产品对酪氨酸酶活性具有一定抑制作用。

4 结论

综上研究，燕麦、椰粉及传统药食同源原料在抑制酪氨酸酶活性及抑制黑色素形成上均发挥重要作用。在体外酪氨酸酶抑制率检测中，燕麦、椰粉、烟酰胺锌单独使用或组合使用均具有酪氨酸酶活性抑制的功能，燕麦和椰粉组合表现出一定协同作用。该燕麦配方是否可通过食用方式直接作用于改善皮肤需进一步的临床验证和深入研究。然而，经体外试验证实，品牌A即食麦片能够抑制黑色素形成的关键酶——酪氨酸酶的活性，其中发挥主要作用的为燕麦和椰粉。