微泡菌昆布多糖酶Lam128A 的酶学性质及酶解产物抗氧化活性

李鹤宾，王杨，银小倩，胡青松，吴婷，朱艳冰*

（1.厦门医学院药学系，福建厦门361023）（2.集美大学海洋食品与生物工程学院，福建厦门 361021）

昆布多糖（Laminarin）是一种水溶性天然多糖，主要来源于海带（Laminaria digitata）等褐藻细胞，是褐藻的重要贮藏多糖，约占其干重35%[1,2]。昆布多糖是一种带有β-1,6-侧链的线性β-1,3-葡聚糖分子，其结构特征随藻类不同而存在差异[3]。昆布多糖可作为糖化和发酵后生物燃料生产的初始物质，属于可再生生物质[4]。昆布多糖的降解产物具有抗氧化、抗凝血、抗细胞凋亡和抗肿瘤等生物活性，具有广泛的应用前景[5-7]。目前已有许多方法应用于昆布多糖降解，例如光催化降解[8]、γ射线辐射降解[9]和酶水解[10]。由于酶法降解具有专一性强、效率高、反应条件温和、产物易于控制，且最大限度地减少对糖分子修饰等特点，成为昆布多糖降解的优选方法。

昆布多糖酶（EC 3.2.1.39）又称为内切β-1,3-葡聚糖酶，是一种专一性水解β-1,3-葡聚糖中的β-1,3-糖苷键的酶类[11]。昆布多糖酶来源广泛，包括细菌、真菌、植物和软体动物等，其中微生物是该酶的重要来源。植物来源昆布多糖酶主要归属于糖苷水解酶17 家族（GH17），而细菌来源昆布多糖酶主要归属于GH16。目前已经报道的产昆布多糖酶的微生物包括强烈炽热球菌（Pyrococcus furiosus）[12]、类芽孢杆菌（Paenibacillussp.）[13]、纤维化纤维菌（Cellulosimicrobium cellulans）[14]、海洋红嗜热菌（Rhodothermus marinus）[15]、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）[16]、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）[17]等。

在前期研究中，从腐烂海带中分离到海洋微泡菌ALW1（Microbulbifersp.ALW1）[18,19]，该菌株的全基因组分析显示，基因Lam128A预测编码昆布多糖酶，本文进行微泡菌昆布多糖酶Lam128A 的克隆表达、酶学性质及酶解产物的抗氧化活性研究，为昆布多糖酶Lam128A 和昆布寡糖的进一步开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

海洋细菌Microbulbifersp.ALW1、E.coliDH5α、Pichia pastorisGS115 以及pPIC9K 质粒均为本实验室保藏。10 kDa 的超滤离心管为Millipore 公司产品；TaqDNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、dNTPs、NotI、EcoR I、BCA 蛋白质测定试剂盒为TaKaRa 公司产品；质粒DNA 小量纯化试剂盒购自天根生化科技有限公司；DEAE-Sephrose Fast Flow 阴离子交换树脂为GE Healthcare 公司产品；昆布多糖、普鲁兰多糖、可溶性淀粉、木聚糖购于Sigma-Aldrich 公司；石耳葡聚糖购于ELICITYL-OligoTech 公司；其余化学试剂均为分析纯级产品。

1.2 主要仪器与设备

Avanti J-25 冷冻离心机，美国Beckman 公司；Epoch2T 微量酶标仪，美国BioTek 公司；冷冻干燥机，美国Thermo Fisher Scientific 公司；恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 昆布多糖酶Lam128A 的序列分析

利用ExPASy 中的ProtParam 工具对昆布多糖酶Lam128A 的DNA 和蛋白质序列、理论分子量和等电点等理化性质进行预测分析。采用信号肽预测工具SignalP v4.1 对昆布多糖酶的信号肽进行预测。在碳水化合物活性酶（Carbohydrate-Active Enzyme，CAZy）数据库中寻找不同家族来源的特征昆布多糖酶的蛋白质序列，利用MEGA7.0 构建微泡菌昆布多糖酶Lam128A 的系统发育树。

1.3.2 昆布多糖酶Lam128A 的克隆及其在毕赤酵母中的表达

以微泡菌ALW1 的基因组为模板，利用正向引物Lam128A-F（5'-ATTTGCGGCCGCTATGACTGCAGTG CAACCC-3'，下划线为NotI 位点）和反向引物Lam128A-R（5'-CCGGAATTC GCGATTGCGGATTTTG TCC-3'，下划线为EcoRI 位点）扩增昆布多糖酶Lam128A 基因，将目的基因克隆到pPIC9K 载体中，并经测序验证DNA 序列后，利用毕赤酵母GS115 细胞表达目的蛋白。将含有昆布多糖酶Lam128A 基因的毕赤酵母GS115 接种于YPD 种子培养基（20 g/L 胰蛋白胨、10 g/L 酵母提取物、20 g/L 葡萄糖、pH 值6.0）中，30 ℃、220 r/min 培养18 h。将菌液按1%接种量接入BMGY 培养基（20 g/L 蛋白胨、10 g/L 酵母提取物、100 mmol/L 磷酸钾、1.34 g/L YNB、4×10-5%生物素、10%甘油，pH 值6.0）中，30 ℃、220 r/min 进行培养，当OD600达到3.0～5.0 时，静置使菌体沉降。弃去上清，加入100 mL BMMY 培养基（20 g/L 蛋白胨、10 g/L 酵母提取物、100 mmol/L 磷酸钾、1.34 g/L YNB、4×10-5%生物素、0.5%甲醇，pH 值6.0）重悬菌体，继续进行培养（30 ℃、220 r/min）。每隔24 h，按体积比0.5%向培养基中加入甲醇，进行昆布多糖酶的诱导表达。培养7 d 后，4 ℃条件下8 000×g离心20 min，获得的上清液即为昆布多糖酶的粗酶液。

1.3.3 重组昆布多糖酶（rLam128A）的分离纯化

利用10 ku 的超滤膜对粗酶液样品进行浓缩，浓缩液经50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 值7.0）透析后，上样于DEAE-Sephrose Fast Flow 阴离子交换层析柱（1.5×10 cm）。用相同缓冲液以1 mL/min 的流速进行流洗，待流出液的OD280趋近于零后，用含0.05～1.0 mol/L NaCl 的50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 值7.0）缓冲液以1 mL/min 的流速对结合蛋白进行线性洗脱。在280 nm 处监测洗脱液，并进行昆布多糖酶的活力测定，收集有酶活性的样品，并利用50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 值7.0）进行透析。利用BCA 蛋白质测定试剂盒测定样品的蛋白质浓度，并进行SDS-PAGE 分析。

1.3.4 昆布多糖酶的活力测定

采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定昆布多糖酶的活力[20]。取450 μL 浓度5 mg/mL 昆布多糖底物溶液（溶于50 mmol/L 醋酸盐缓冲液，pH 值5.5），加入50 μL 昆布多糖酶（0.5 mg/mL），于45 ℃条件下反应30 min 后，加入500 μL DNS 试剂，沸水浴处理10 min 后，在540 nm 处测定反应液的吸光值。在上述条件下，每分钟水解底物产生1 μmoL 还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为1 个酶活力单位（U）。

1.3.5 重组昆布多糖酶的底物特异性分析

以5 mg/mL 的昆布多糖、普鲁兰多糖、可溶性淀粉、木聚糖和石耳葡聚糖为底物来测定酶的活力，研究酶对不同类型糖苷键的水解能力。分别将50 μL 酶溶液（0.5 mg/mL）加入450 μL 相应底物溶液（溶于50 mmol/L 醋酸盐缓冲液，pH 值5.5），45 ℃反应30 min后，利用DNS 法测定酶的活力。

1.3.6 温度对重组昆布多糖酶活性和稳定性的影响

以5 mg/mL 昆布多糖为底物，测定不同温度（25～65 ℃）下rLam128A 的活力，以最高酶活力为100%，研究酶的最适反应温度。将rLam128A 置于不同的温度（25～60 ℃）下处理1 h，测定酶的残余活力，以未经热处理的酶活力为 100%，研究温度对rLam128A 稳定性的影响。

1.3.7 pH 值对重组昆布多糖酶活性和稳定性的影响

配制不同pH 值的缓冲液：50 mmol/L 醋酸盐缓冲液（pH 值3.0～6.0）、50 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH 值6.0～7.0）、50 mmol/L Tris-HCl（pH 值7.0～9.0）、50 mmol/L甘氨酸-NaOH（pH 值9.0～11.0），在不同pH 值条件下测定酶的活力，以最高酶活力为100%，研究昆布多糖酶rLam128A 的最适反应pH 值。将昆布多糖酶rLam128A 在不同pH 值条件下（pH 值3.0、5.0、11.0）、25 ℃处理120 h，每隔24 h 检测昆布多糖酶rLam128A的残余酶活力，以未处理的酶活力为100%，研究pH值对昆布多糖酶rLam128A 稳定性的影响。

1.3.8 重组昆布多糖酶的动力学参数测定

用50 mmol/L 醋酸盐缓冲液（pH 值5.5）配制浓度为0～18 mg/mL 的昆布多糖溶液，将昆布多糖酶rLam128A 分别与不同浓度的昆布多糖反应，测定酶的活力。利用Lineweaver-Burk 双倒数作图法，计算昆布多糖酶rLam128A 的最大反应速度（Vmax）与米氏常数（Km）。

1.3.9 化学试剂对重组昆布多糖酶稳定性的影响

将昆布多糖酶rLam128A 分别利用终浓度为1 mmol/L 或10 mmol/L 的不同金属离子、终浓度为2 mmol/L 或10 mmol/L 的金属螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）和还原试剂二硫苏糖醇（DTT）、终浓度为0.2%（m/V或V/V）或2%（m/V或V/V）的去垢剂[Triton X-100、Tween 20、Tween 80、十二烷基硫酸钠（SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）]、终浓度为2 mol/L或5 mol/L 的变性剂尿素，在25 ℃处理1 h 后，测定rLam128A 的残余酶活力，以未经化学试剂处理的酶活力为100%，研究化学试剂对rLam128A 稳定性的影响。

1.3.10 酶解产物的制备及抗氧化活性研究

利用50 mmol/L 醋酸盐缓冲液（pH 值5.5）配制10 mg/mL 的昆布多糖溶液，100 mL 底物溶液中加入2.6 U 重组昆布多糖酶，40 ℃反应12 h，用沸水浴处理10 min。4 ℃条件下8000×g离心20 min，利用10 ku的超滤离心管对所得上清液样品进行浓缩，收集滤过液，冷冻干燥至粉末。参考Zhu[18]等的方法，对酶解产物清除DPPH 自由基、ABTS 自由基、·OH 自由基的能力及酶解产物的还原能力进行测定，研究酶解产物的抗氧化活性。

1.3.11 数据处理

每组试验设置3 次平行，数据应用Excel 软件计算平均值，利用SPSS Statistics V17.0 软件进行差异显著性分析（p＜0.05）。

2 结果与讨论

2.1 微泡菌昆布多糖酶Lam128A 的序列分析

微泡菌ALW1的昆布多糖酶Lam128A基因的开放阅读框由1545 bp 组成，编码具有514 个氨基酸的蛋白质，预测的理论分子质量为54.46 ku，理论pI 值为4.16。1-23 个氨基酸残基预测为信号肽。系统进化分析显示，Lam128A 与Lentinula edodes来源的昆布多糖酶（BAL27560.1）在同一分支（图1），后者是GH128家族的代表，说明本研究的微泡菌昆布多糖酶归属于GH128 家族。

2.2 昆布多糖酶Lam128A 的体外表达与底物特异性

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对表达蛋白进行检测，重组昆布多糖酶rLam128A 的大小在70 ku 左右（图2a），大于理论预测值，可能是由于蛋白质的糖基化修饰。酶的底物特异性分析显示，微泡菌rLam128A 除了对昆布多糖（β-1,3，β-1,6）有较好的水解性能外，对普鲁兰多糖（α-1,4，α-1,6）、可溶性淀粉（α-1,4）、木聚糖（β-1,4）和石耳葡聚糖（β-1,6）底物的水解效果不明显（图2b）。rLam128A 对上述多糖的活性谱表明，rLam128A 主要作用于含有β-1,3-糖苷键的昆布多糖，表明其是一种β-1,3-葡聚糖酶。rLam128A 的底物特异性与Flavobacteriumsp.来源的昆布多糖酶相似[21]，但与来自Vibrio.campbellii的昆布多糖酶不同，后者对海带二糖（β-1,3）有强烈的偏好，但也催化纤维二糖（β-1,4）和龙胆二糖（β-1,6）[22]。

图2 昆布多糖酶Lam128A 的体外表达（a）及底物特异性（b）Fig.2 Expression of laminarinase Lam128A (a) and its substrate specificity (b)

2.3 重组昆布多糖酶的酶学性质

测定不同温度下rLam128A 的活力，发现酶的最适反应温度为45 ℃（图3a）。该酶在25～45 ℃处理1 h后，残余酶活性在95%以上；在50 ℃处理1 h 后，酶活力保留39.37%（图3b）。rLam128A 与来自Arca inflata的昆布多糖酶类似[23]，在55 ℃下失活（表1）；而S.cerevisiae来源的昆布多糖酶只在小于37 ℃的情况下稳定[24]（表1）；Aplysia kurodai来源的昆布多糖酶AKLam33 在45 ℃下温浴15 min 后，残余酶活力仅剩50%[25]（表1）。在不同pH 值缓冲液中测定昆布多糖酶的活力，酶的最适反应pH 值为5.5（图3c）。4 ℃条件下，分别在pH 值3.0、5.0 和11.0 条件下处理96 h 后，残留酶活力仍有60%以上（图3d），说明在强酸和强碱环境下，微泡菌rLam128A 的pH 稳定性都非常好。rLam128A 在极端酸性和碱性条件下的pH 值稳定性优于来自Streptomyces matensis[26]和Mitsuaria chitosanitabida[27]的昆布多糖酶（表1）。微泡菌重组昆布多糖酶的动力学参数Km和Vmax分为4.34 mg/mL 和0.21 U/mg。

表1 一些表征的昆布多糖酶的热稳定性和pH 稳定性Table 1 Thermostability and pH stability of some characterized laminarinases

图3 温度和pH 对rLam128A 活性和稳定性的影响Fig.3 Effects of temperature and pH on the activity and stability of rLam128A

2.4 化学试剂对重组昆布多糖酶稳定性的影响

测定不同金属离子对rLam128A 稳定性的影响，结果如图4a 所示。1 mmol/L K+对酶活力有微弱促进作用；Na+、Mg2+和Ba2+对酶活力有促进作用，随着浓度升高促进作用增强。与之类似的，郑必胜等[28]的研究表明，Ba2+对裂褶菌来源的酶具有促进作用。10 mmol/L的Ca2+对酶活力有促进作用，而低浓度对酶活力无影响。Cu2+、Zn2+、Cd3+、Al3+和Fe3+对酶活力产生不同程度的抑制作用，Lee 等[11]的研究也表明，Cu2+和Zn2+对昆布多糖酶具有抑制作用。1 mmol/L 的金属离子中，Cu2+的抑制作用最强；10 mmol/L 的金属离子中，Al3+的抑制作用最强，酶活力基本丧失。

图4 化学试剂对rLam128A 稳定性的影响Fig.4 Effects of chemical reagents on the stability of rLam128A

测定其他化学试剂对rLam128A 稳定性的影响，结果如图4b 所示。还原试剂DTT 对酶活力有促进作用，且随浓度的升高促进作用明显增强，而螯合剂EDTA对酶活力影响不大。除了SDS 和CTAB，rLam128A 对测试的其他去垢剂表现出一定的稳定性，2%的Tween 20 和Tween 80 室温处理1 h，可以保留不低于60%的酶活力，而同样条件下经Triton X-100 处理后，酶活力保留38.57%。rLam128A 对尿素表现出一定的稳定性，5 mol/L 尿素室温处理1 h，可保留50.44%残余酶活力。

2.5 酶解产物的抗氧化活性

研究表明，分子结构、单糖单元的数量、支化度和长度，都可能影响昆布多糖的抗氧化活性[29]。昆布多糖经昆布多糖酶水解的产物主要为单糖、二糖和五塘等小分子单糖和寡糖[30]。本研究中，利用重组昆布多糖酶rLam128A 制备昆布多糖酶解产物，并进行产物的抗氧化活性分析。结果显示，当质量浓度为12.50 mg/mL时，酶解产物对DPPH 自由基的清除率达到63.62%，而昆布多糖对该自由基的清除率仅为14.40%（图5a），酶解产物对DPPH 自由基的半抑制浓度IC50为7.12 mg/mL。当质量浓度达到2.40 mg/mL 时，酶解产物对ABTS 自由基的清除率达到84.45%，而昆布多糖对该自由基的清除率仅为3.27%（图5b），酶解产物对ABTS 自由基的半抑制浓度IC50为1.01 mg/mL。昆布多糖及其酶解产物均对·OH 自由基表现出良好的清除效果（图5c），酶解产物对·OH 自由基的半抑制浓度IC50为2.40 mg/mL，低于昆布多糖。由图5d 可知，随着质量浓度的增大，昆布多糖及其酶解产物的还原能力均增强，但相较于昆布多糖，酶解产物的还原能力更强。综上，rLam128A 水解昆布多糖，获得的酶解产物具有更高的抗氧化活性。

图5 昆布多糖及其酶解产物的抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activities of laminarin and its enzymatic hydrolysis products

3 结论

本研究中，从海洋细菌Microbulbifersp.ALW1 中克隆昆布多糖酶Lam128A 基因，并在毕赤酵母中进行表达，获得的重组昆布多糖酶rLam128A 具有良好的温度稳定性，以及强酸和强碱环境中的稳定性。rLam128A能特异性水解昆布多糖，且水解产物的抗氧化能力提高。重组昆布多糖酶rLam128A 成为可能的工具酶，促进昆布多糖的高值化开发利用。