艾沙康唑、伏立康唑、两性霉素B对我国多中心临床分离丝状真菌的体外药物敏感性评估

井然，郭大文，王俊瑞，贺靖冬，王瑶，徐英春*

1中国医学科学院北京协和医院检验科，疑难重症及罕见病国家重点实验室，北京协和医院，北京 100730；2中国医学科学院北京协和医学院，北京 100730；3侵袭性真菌病机制研究与精准诊断北京市重点实验室，北京 100730；4哈尔滨医科大学附属第一医院检验科，哈尔滨 150007；5内蒙古医科大学附属医院检验科，内蒙古 750306；6天津市胸科医院检验科，天津 300051

近年来，随着抗真菌药、激素、免疫抑制剂的广泛使用和侵入性治疗的增加，我国和其他国家一样，侵袭性肺曲霉病和毛霉病发病率逐渐增高[1-2]。

目前，伏立康唑（voriconazole，VOR）是被推荐用于治疗侵袭性肺曲霉病的主要抗真菌药物[3]，然而对VOR耐药的烟曲霉感染患者的报道越来越多[4]。两性霉素B（amphotericin B，AMB）被推荐用于治疗毛霉病[5]，但存在药物不良反应，如肾毒性等[6]。因此，目前用于治疗侵袭性真菌病的药物十分有限。国外已有研究报道艾沙康唑（isavuconazole，ISA）对大范围的酵母菌和丝状真菌有较强的体外活性[7-8]。本研究旨在评估ISA对我国多中心临床分离的曲霉属和毛霉目菌株的体外活性，为指导临床治疗提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 资料来源

收集来自2017～2020年中国医院侵袭性真菌病监测网（CHIF-NET）中国北方，包括北京、天津、内蒙古、河北、黑龙江、吉林、辽宁和山西8个地区合作医院的临床分离丝状真菌，共计131株。所有菌株统一传种在沙氏葡萄糖琼脂培养基[Sabouraud Dextrose Agar，SDA （Thermo Fisher Scientific）]，于28℃孵育3～7天。

1.2 研究方法

1.2.1 菌种鉴定

所有菌种采用传统形态学结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行鉴定，同时对未鉴定出结果的菌株进行rDNA的ITS区域或28S rRNA的D1/D2区测序。

1.2.2 药物敏感性检测

依据CLSI M38-A3的微量肉汤稀释法进行体外药物敏感性检测[9]，药敏板由IHMA（Europe Sarl）提供，包含3种抗真菌药物，即ISA（MICs：0.008～8μg/ml）、VOR（MICs：0.008～8μg/ml）和 AMB（MICs：0.06～8μg/ml），其中VOR和AMB作为研究ISA敏感性的参考类抗真菌药。近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC 6258作为药敏试验的质控菌株，烟曲霉ATCC MYA-3627TM和黄曲霉ATCC 204304TM作为参考菌株[10]。

1.2.3 数据分析

依据CLSI M59和CLSI M57S[11-12]，目前只建立了 VOR、ISA和AMB对常见的曲霉属，包括烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉的流行病学界值（epidemiological cutoffvalues， ECVs）。尚未建立毛霉目的ECV，因此通过计算50%最低抑菌浓度（50% minimun inhibitory concentration，MIC50）和90%最低抑菌浓度（90% minimun inhibitory concentration，MIC90）来评估抗真菌药对毛霉目的体外活性[11-12]。

2 结果

2.1 菌种鉴定

临床共分离丝状真菌131株，最终鉴定出曲霉属105株和毛霉目26株。105株曲霉属中，烟曲霉复合群（A.fumigatuscomplex）占所有曲霉属的71.4%（75/105），其次是黑曲霉复合群（A.nigercomplex）占10.5%（11/105），黄曲霉复合群（A.flavuscomplex）占9.5%（10/105）和土曲霉复合群（A.terreuscomplex） 占 8.6%（9/105）。 在 26株 毛 霉 目中，以根霉属为主，占50%（13/26）[其中，米根霉/少根根霉（R.oryzae/R.arrhizus）占84.6%（11/13），小孢根霉（R.microspores）和匍枝根霉（R.stolonifera）各有1株]。其次为根毛霉属[占15.4%（4/26），包含3株微小根毛霉（R.pusillus）和1株米黑根毛霉（R.miehei）]和横梗霉属[占15.4%（4/26），均为分枝横梗霉（Lichtheimia ramosa）]。最后为共头霉属[占 11.5%（3/26），均为总状共头霉（S.racemosum）]和毛霉属[仅有2株，均为卷枝毛霉（M.circinelloides）]。

2.2 ISA、VOR和AMB对不同曲霉属体外药物敏感性比较

研究总结了ISA、VOR和AMB对不同曲霉属的作用效果（见图1）。根据CLSI-M59对部分曲霉ECVs的判断标准[11]，当测定某一抗真菌药对某菌株的MIC值≥ECV值时，该菌株被定义为对这种抗真菌药的非野生型菌株，在本研究中我们可以解释为 “耐药”；相反，当MIC值

图1 ISA、VOR和AMB对不同曲霉属的体外药物敏感性交叉比较

如图1A所示，在75株烟曲霉复合群中，有67株（67/75，89.3%）对AMB耐药。在对AMB耐药的烟曲霉复合群的菌株中，有4株对ISA和VOR耐药（6.0%，4/67），剩余63株对ISA和VOR均敏感。对比AMB，烟曲霉复合群对ISA和VOR 2种唑类药物同时敏感的菌株占比为92.0%（69/75）。此外，对ISA耐药的6株烟曲霉复合群菌株中，有5株VOR耐药株和1株VOR敏感株。

如图1B所示，在10株黄曲霉复合群菌株中，10株均对VOR敏感，有2株对ISA耐药。在对AMB耐药的4株菌株中，有1株对ISA耐药。对比AMB，黄曲霉复合群对ISA和VOR 2种唑类药物同时敏感的菌株占比为80.0%（8/10）。

如图1C所示，在11株黑曲霉复合群中，有4株对AMB耐药的同时，对ISA和VOR敏感。对比AMB、ISA和VOR对黑曲霉复合群均有较好的活性，均敏感（100%）。

如图1D所示，在9株土曲霉复合群中，仅1株菌（11.1%，1/9）对AMB耐药，9株（100%）均对ISA和VOR敏感。

2.3 ISA、VOR和AMB对毛霉目体外药物敏感性分析

体外药敏结果显示（见表1），VOR对所有毛霉目均无活性，MIC值范围为4～>8 μ g/ml，中位数 MIC 值（mMIC）、MIC50和 MIC90均>8 μ g/ml。ISA对毛霉目的药敏结果显示，毛霉属和共头霉属对ISA的MIC值范围分别为0.5～8μg/ml和0.5～>8μg/ml，各有1株卷枝毛霉和总状共头霉对ISA耐药（MIC>8μg/ml）。ISA对根霉属、根毛霉属和横梗霉属有较强的体外活性，MIC值范围分别 为 0.06～2、0.25～1μg/ml和 0.06～2μg/ml。 对比VOR和ISA，AMB对毛霉目不同种均有较好的活性，MIC值范围为0.12～2μg/ml。

表1 ISA、VOR和AMB对毛霉目的体外药物敏感性μg/ml

3 讨论

近些年，侵袭性霉菌感染的发病率逐年升高[13]，除曲霉属为主要病原体外，毛霉目是另一类常见的病原体。由于近年来新冠肺炎疫情，许多国家报道了新冠肺炎（COVID-19）合并肺曲霉病和毛霉菌肺炎的病例[14-18]。毛霉病与血管侵犯有关，死亡率高于侵袭性肺曲霉病，可达50%～70%[19]，且在糖尿病患者中的发病率逐渐增高[20-23]。

ISA已于2015年被美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）获批用于治疗侵袭性肺曲霉病和毛霉病，同时ISA也被推荐作为治疗侵袭性霉菌感染的一线药物[24]。

但随着烟曲霉对唑类药物耐药不断被报道[4]，当遇到唑类药物耐药的烟曲霉感染时，AMB可作为治疗方案[24]。然而，大规模和长期使用AMB可能会降低其对烟曲霉复合群的敏感性，逐渐出现对AMB耐药的烟曲霉复合群菌株。如加拿大报道了AMB对一批烟曲霉菌株有更低的敏感性，耐药率达96.4%（188/195），高于本研究中烟曲霉复合群菌株对AMB的耐药率（89.3%）[25]。本研究为我国首次开展的多中心ISA对临床分离的丝状真菌的体外药物敏感性评估，结果显示对烟曲霉复合群、黄曲霉复合群、黑曲霉复合群和土曲霉复合群，VOR和ISA的作用效果相似。此外，有研究指出与VOR相比，ISA有更广泛的活性谱（包括对大多数毛霉目真菌）及良好的耐受性，可加载剂量后每日1次给药，且其为线性药动学，具有水溶性和更少的细胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP450）介导的药物与药物间的相互作用[26-27]。基于此，提示ISA同样可以作为治疗侵袭性曲霉感染的治疗药物[27]。

根据相关指南推荐[28]，治疗毛霉病的一线抗真菌药是AMB。本研究结果与指南推荐一致，即AMB对毛霉目菌株均有较好的活性（MICs为0.12～2μg/ml）。虽然AMB是有效的，但会产生肾毒性等不良反应，在治疗毛霉病时需要控制好使用剂量和治疗时间[29-30]。本研究结果显示，VOR对所有毛霉目均无活性（MICs为4～>8 μ g/ml），与国外相关报道的结果一致[31-33]。

本研究尚存在一些局限型。首先，收集的菌株来自中国北方地区的合作医院，所以目前的药敏数据仅可代表中国北方地区的临床菌株的药敏表型，未来需扩大更多的合作医院，收集来自全国各个区域的临床菌株进行全国多中心的研究；其次，由于临床毛霉目菌株十分有限，目前只收集到了26株，未来仍需继续扩大范围和累积收集年限，收集更多毛霉目菌株。

综上所述，本研究多中心体外药敏结果可为临床治疗侵袭性肺曲霉病和毛霉病的参考，即ISA对曲霉属的体外活性不次于VOR，且对大部分毛霉目具有良好活性，可作为治疗初级侵袭性霉菌感染的治疗药物；而VOR对所有毛霉目均无活性；AMB对毛霉目的活性较强，但需要注意在治疗侵袭性霉菌感染中其带来的不良反应。