干腌火腿中肽的形成机理研究进展

李平，张志，周辉*，周凯，王兆明，马晓钟，徐宝才*

1(农产品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥，230009)2(合肥工业大学 食品与生物工程学院，安徽 合肥，230009) 3(安徽旺德福食品有限公司，安徽 淮北，235000)4(金字火腿股份有限公司，浙江 金华，321000)

干腌火腿具有悠久的历史，其加工工艺繁琐，对原料产地、加工环境要求严格，因此火腿具有特殊的风味。长期的发酵也让腿肉中的营养物质更易被人体吸收，更快补充蛋白质、脂质和微量元素，成为深受世界消费者喜爱的产品。闻名世界的火腿包括：中国浙江金华火腿、江苏如皋火腿、云南宣威火腿与诺邓火腿、西班牙的伊比利亚火腿与塞拉诺火腿、意大利的帕尔马火腿与圣丹尼火腿、法国的巴约纳火腿、德国黑森林火腿等。从地理位置来看，优质火腿产地主要集中在中国和地中海地区，从产品特点来看，火腿肉香浓郁、色泽鲜艳，且食用方式多样，可以佐餐、炒制或是熬汤提鲜。经过近几十年的发展，干腌火腿在加工过程中产生的多种功能性肽已成为研究的热点。

功能性肽(尤其动物来源的肽)是指来自动物食物中由 2～30 个氨基酸组成且对生物机体的活动有益或具有生理作用的肽类化合物[1]，一般分为生物活性肽和呈味肽。生物活性肽是指除基础的营养功能外，还可在生物体内起重要的生理作用，发挥特定生理功能的肽类物质，一般具有调节血压、提高免疫力、消除炎症、降低胆固醇、降低血脂和抗凝血等作用[2-3]。呈味肽是干腌火腿产品特殊滋味的重要来源，呈味肽产生于蛋白质降解，主要包含的特征滋味有：鲜味、甜味、苦味、酸味、咸味及浓厚感。国内外对呈味肽的研究为产品品质的提升以及新产品的研发提供了重要的理论依据。

干腌肉制品具有独特的加工工艺以及漫长的加工过程，期间肌肉蛋白质降解程度高，富含多肽，成为天然功能性肽的重要来源。目前，国内外针对干腌火腿中功能性肽的研究集中在生物活性肽的功能特性和呈味肽的呈味机理，本文综述近年来国内外干腌火腿中的功能性肽及其产生机理的相关报道，旨在为干腌火腿品质提升和新工艺设计提供理论指导。

1 干腌火腿中肽的功能特性研究

1.1 干腌火腿中肽的生物活性

干腌火腿在原料加工过程中，由于内源酶和微生物的共同作用，肌肉蛋白质发生显著降解，产生一系列具有特定生物活性的肽。国内外学者对火腿中生物活性肽的研究较多，总结起来有以下功能特征：抗氧化活性、降血压活性、抗菌活性以及降血糖和抗炎症功能。抗氧化活性研究成果很多，西班牙干腌火腿、浙江金华火腿、云南宣威火腿等均分离出具有较强的抗氧化活性肽[4-6]。肽的抗氧化活性主要与氨基酸序列有关而且抗氧化肽序列中通常含有疏水性氨基酸残基，一般来说疏水性越高，肽的抗氧化能力越强[7-8]。降血压肽主要通过抑制血管紧张素I转移酶 (angiotensin I converting enzyme，ACE) 的活性进而抑制血管收缩发挥降低血压的作用。目前，在西班牙传统干腌火腿、伊比利亚火腿以及浙江金华火腿中均发现了降血压肽[9-11]。降血压肽通常在肽段的C末端和N末端对氨基酸种类有特殊要求，使得肽的结构与ACE的作用底物血管紧张素I类似，因而能与ACE结合，使得ACE失去原有的活性[12]。抗菌肽的功能实现依赖于其两亲性的结构，该结构使得抗菌肽更容易通过细胞膜，干扰细胞正常的功能进而发挥抑菌作用[13]。邢璐娟等[14]在云南宣威火腿中提取分离出对大肠杆菌O157和单增李斯特菌的抗菌肽，CASTELLANO等[15]在西班牙干腌火腿中提取分离得到对单增李斯特菌具有抑制作用的抗菌肽。

随着众多国内外学者对干腌火腿中生物活性肽的研究不断深入，具有其他功能的生物活性肽也逐渐被发现，如在西班牙干腌火腿中提取分离得到对二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase IV，DPP-IV)具有抑制作用的肽[16]，而DPP-IV是II型糖尿病治疗的靶点，因此该活性肽能有效降低血糖浓度。GALLEGO等[17]在干腌火腿中提取得到能够降低机体炎症反应的肽。

国内对于降血糖肽和抗炎症肽的研究尚未有文献报道，新型生物活性肽的提取分离和功能特性研究是干腌肉制品研究领域的热点，未来从干腌肉制品中提取天然生物活性肽，在解决当今人类面临的重大健康疾病难题中将发挥重要作用。

1.2 干腌火腿中肽的呈味特性

干腌火腿的风味主要由滋味和香味组成，来源于原料在加工过程中发生的美拉德反应、蛋白质水解、脂质氧化以及其他成分的降解。香味物质一般具有挥发性，主要来源于食品中各类营养素的化学反应，形成各种醛类、醇类、酯类、酸类、酮类和烃类等物质。在火腿的滋味特征中，各类呈味肽发挥着重要作用，呈味肽是指在产品中呈现滋味的肽，来源于加工过程中蛋白质的降解。研究表明呈味肽在发酵食品中是重要的风味物质，可以呈现出苦味、鲜味或浓厚味[18]。

火腿中鲜味肽的研究成果较多，大多数鲜味肽为二肽、三肽等低分子寡肽。谷氨酸和天冬氨酸作为具有鲜味的氨基酸，由于本身能有效提升产品中的鲜味，在鲜味肽的增鲜作用研究中也通常将二者作为特征氨基酸。1978年，YAMASAKI等[19]用木瓜蛋白酶水解牛肉，得到的一种氨基酸序列为 Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala 的八肽，命名为鲜味肽。目前在其他肉制品如猪肉、鱼肉和植物产品如大豆、小麦中均发现了鲜味肽，尤其对发酵制品如发酵鱼、火腿、酱油等鲜味肽的研究较多。王娟[20]对金华火腿中的小肽进行分离纯化和鉴定，结果表明Ser-Glu、Val-Glu、Leu-Glu、Glu-Glu-Glu和Glu-Gly-Ser这5种肽呈现出鲜味特征。DANG等[21]发现意大利帕尔玛火腿和金华火腿的鲜味肽在呈味特征上有一定的相似性，其中金华火腿鲜味肽氨基酸序列为Cys-Cys-Asn-Lys-Ser-Val、帕尔玛火腿鲜味肽序列为Ala-His-Ser-Val-Arg-Phe-Tyr。在酸、甜、苦、咸、鲜5种滋味的基础上，浓厚感是指能够提高滋味的后味，进一步丰富食品的整体味感、增强滋味的持续性和延渗性，使人深感味的厚度和广度[22]。UEDA等[23]从大蒜中分离出的具有鲜味增强作用的氨基酸衍生物，目前具有浓厚感作用的肽类物质主要是γ-谷胱甘肽、γ-谷氨酰肽类以及一些低分子肽类[24]。

苦味肽主要以寡肽的形式存在于干腌火腿中，SENTANDREU等[25]从西班牙干腌火腿中通过色谱法分离提取得到许多苦味二肽，氨基酸序列测定为 Ile-Val、Leu-Gly、Ile-Asp 和 Pro-Leu。王娟[20]在金华火腿中分离出呈苦味的寡肽Pro-Leu和Leu-Lys。多数研究表明肽的苦味和其疏水性关系密切，肽的疏水性使肽能够在口腔中与苦味受体的活性部位结合，从而产生苦味[26]。其他类别的呈味肽如甜味肽、酸味肽和咸味肽在干腌火腿中的研究较少。

2 干腌火腿中肽的形成机理研究

干腌火腿的加工过程包括原料腿筛选、腌制、晾晒整形、发酵和后熟，较长的加工时间导致肌肉蛋白质发生降解，各种功能性肽在加工过程中形成。在加工前期的腌制阶段，低温和高盐的环境下肌肉内源酶的作用是导致蛋白质水解、活性肽形成的主要原因，特别是组织蛋白酶 B、D、H 和 L 和外肽酶(肽酶和氨肽酶)以及钙激活蛋白酶[18]。在发酵及后熟阶段，适宜的温湿度能够激活蛋白酶的活力，同时由于微生物可以通过直接代谢或者分泌胞外蛋白酶进而降解肌肉蛋白质产生多肽及其衍生产物，因而在这个阶段火腿区系微生物与肌肉内源酶共同主导蛋白质的降解[27]。通过国内外学者对干腌火腿中蛋白质降解规律的研究，结合蛋白质组学技术，发现火腿加工过程中肌原纤维蛋白是发生降解的主要蛋白[28-30]。

2.1 加工工艺对肽的形成影响研究

不同干腌火腿原料的选择不同，如金华火腿选用金华“两头乌”的鲜猪后腿，宣威火腿选用宣威乌金猪，伊比利亚火腿选用伊比利亚猪，巴马火腿选用大白猪、长白猪和杜洛克猪等。火腿加工条件如环境温湿度和处理时间在不同产品中要求不同，主要在腌制和成熟这2个阶段存在较大区别，马晓钟等[31]研究比较了中国传统火腿金华火腿和意大利帕尔马火腿的工艺差异，其中金华火腿腌制过程中环境温度为0～15 ℃，发酵环境温度为15～38 ℃，环境相对湿度为40%～70%，而帕尔马火腿腌制过程环境温度控制在0～4 ℃，发酵环境温度控制在15～25 ℃，且环境相对湿度更高。腌制阶段的上盐量也有较大差异，例如金华火腿总用盐量为腿胚重的6.5%～8.0%，分5～7次上盐，宣威火腿总用盐量为7%左右，分3～4次上盐等。不同加工工艺导致干腌火腿中蛋白质降解程度存在较大差异，进而影响各类肽的功能特性以及含量。HANSEN-MØLLER等[32]研究发现意大利帕尔马火腿在不同加工时期肽的种类不同，且肽的形成与火腿风味的形成高度相关。小分子肽尤其是寡肽在干腌火腿的滋味形成中具有重要作用，目前分离得到的众多呈味肽大多数为寡肽，而寡肽的形成对火腿加工工艺要求较高且通常在加工后期才开始大量积累。基于对呈味肽的形成过程的认识，目前许多学者通过改进加工工艺来实现小分子肽的富集，进而增强产品的滋味实现风味调控。

干腌火腿加工过程中环境温度变化范围很大，温度的改变往往影响火腿中内源酶活性，进而影响肽的形成。SFORZA等[37]在对帕尔玛火腿的研究中比较了后熟过程中不同温度(26 ℃ 和18 ℃)对寡肽含量的变化影响，在18 ℃ 下后熟的火腿中寡肽含量(分子质量约319 Da)更高，且与26 ℃ 下后熟的火腿相比差异显著，其原因可能是较高温度下内源酶活力较高，寡肽被持续降解。MARTN等[38]研究伊比利亚火腿加工过程中肽的变化，发现在腌制结束后的风干期(晾晒阶段)和发酵期内小分子肽大量形成，其原因可能是伊比利亚火腿干燥过程中环境温度会刺激肌肉来源和微生物来源的蛋白酶，促进蛋白质水解。有关研究表明温度对于内源酶尤其是组织蛋白酶活力影响很大，一般35～40 ℃ 左右酶活力最高，而这一温度很接近在干腌火腿中发酵环节的温度[39]。

腌制是干腌火腿加工的重要环节，食盐可以影响微生物的生长和繁殖，同时调节肌肉中内源酶的活力，影响蛋白质降解。在干腌火腿加工过程中，由于前期NaCl的渗透作用和后期肌肉水分的流失，盐含量在不同的加工阶段均呈现上升趋势，目前国内外干腌火腿产品的含盐量一般为10% 左右。含盐量过高导致火腿水分流失量加大，进一步抑制内源酶活力，微生物的代谢也处于被抑制状态，而含盐量过低则会导致蛋白质过度水解甚至腐败变质。马志方[40]研究低钠盐对金华火腿蛋白质降解的影响，分别按照8%的上盐量制作干腌火腿，结果表明在加工结束后，低钠盐(50%NaCl) 腌制火腿的蛋白质降解指数高于食盐组，而且肌肽含量也显著高于食盐组，提取得到的抗氧化肽的总抗氧化能力也更强。

综上所述，晾晒和发酵阶段的温湿度和时间的控制是决定火腿品质的重要因素，结合现代控温控湿技术能够通过激活相关酶活力或者潜在功能微生物的代谢来调控肽的生成，适当延长发酵时间则能够实现肽的富集，其功能特性也会得到一定的增强。腌制阶段通过影响加工后期火腿含盐量进而调控蛋白质降解程度和肽的含量，结合替代盐技术提高成品火腿中功能肽的含量将有助于进一步提升干腌火腿的品质。

2.2 加工过程中内源酶对肽的形成影响研究

干腌火腿中各类肽来源于肌肉蛋白质的降解，在组成肌肉的各类蛋白质中, 肌原纤维蛋白和肌浆蛋白降解程度最高，基质蛋白降解程度最低。蛋白质降解过程中有许多内源酶参与，目前研究较多而且在肽的形成中发挥重要作用的是肌肉中组织蛋白酶B、D、H和L和钙激活蛋白酶。在整个加工过程中都能检测到蛋白酶的活性，并且蛋白酶的活性与小肽的生成数量及火腿的感官特性高度相关，表明组织蛋白酶的酶促蛋白质降解作用在干腌火腿的特征性风味和质地形成过程中起着重要作用[41]。肌肉中不同的内源酶在不同加工阶段活力不同，对蛋白质降解的作用也不同，在干腌火腿加工过程中，组织蛋白酶 B、H 和 L 于 15 个月后仍具有活性，而组织蛋白酶D在加工6～10个月后活性消失，钙激活蛋白酶仅在腌制过程的第1阶段参与肌肉蛋白质的水解，其稳定性较低且在2周左右活性消失[42]。ZHOU等[43]研究表明金华火腿从腌制到后熟的加工过程中，组织蛋白酶 B 和 L 的活性显著降低，最终仍保留10%左右的活性。

钙激活蛋白酶是细胞内一组半胱氨酸类内肽酶，目前国内外研究中共确定了14种钙激活蛋白酶，其中对于μ-钙激活蛋白酶和m-钙激活蛋白酶的研究成果较多，它们在肉的成熟过程中发挥重要作用。在宰后早期，μ-钙激活蛋白酶和m-钙激活蛋白酶从肌浆中的亚细胞器沿着 Z 线和 I 带逐渐扩散进入肌原纤维中并开始降解该区域的肌原纤维蛋白[44]。MORA等[45]从西班牙索洛纳火腿中得到来源于肌原纤维蛋白的 14 个多肽片段，预测在干腌火腿的加工初期，钙激活蛋白酶可能起到非常重要的作用。BARON等[46]的体外试验发现μ-钙激活蛋白酶和m-钙激活蛋白酶首先酶解肌间线蛋白形成多肽，随后组织蛋白酶发挥作用，将大量多肽继续降解小肽。

组织蛋白酶B、H和L属于半胱氨酸蛋白酶，组织蛋白酶D是一种天冬氨酸酶，溶酶体破裂之后释放组织蛋白酶。肌球蛋白和肌动蛋白是骨骼肌肌原纤维中最常见的2种蛋白而且是功能性肽的重要来源。组织蛋白酶 B对肌动蛋白有显著降解作用，产生的大部分肽类是从蛋白质的N 端和C 端释放出来的，而且大多数为水溶性多肽，这些多肽可能对干腌肉制品的风味具有重要影响[42]。当pH为5.5左右时，组织蛋白酶B和L降解肌原纤维蛋白，且它们能够降解诸如肌联蛋白、肌钙蛋白、伴肌动蛋白、原肌球蛋白等在内的肌原纤维蛋白。相关组织蛋白酶H的研究表明它能够降解肌钙蛋白T[47]。组织蛋白酶D能广泛降解肌原纤维蛋白，在pH值3.0时它能够水解肌球蛋白重链、α-肌动素、原肌球蛋白及肌钙蛋白的T亚基和I亚基；在pH值5.5和37 ℃下能够降解几种肌原纤维蛋白，其中降解最快的包括肌联蛋白、伴肌动蛋白、肌球蛋白的重链及M蛋白和C蛋白[48]。但组织蛋白酶D在加工过程中活性降低较快，主要在加工前中期发挥作用。

总而言之，肌肉中的内源酶种类较多，不同的pH条件下，对蛋白质的降解作用均存在较大的差异，在干腌火腿中随着加工的不断深入，环境温湿度等环境条件的改变以及火腿内部理化性质的改变均能够影响内源酶的活力，因而探究加工过程中肽的含量和相关特性的变化结合内源酶的活性升降进一步解释酶与肽的关系，对于从工艺条件入手调控内源酶活力实现功能肽的富集是当前肉制品研究的重要方向。

2.3 加工过程中微生物对肽的形成影响研究

发酵和后熟是干腌肉制品成熟过程的关键工序，发酵工序的控制好坏直接关系到干腌火腿产品的成品率，后熟工序与火腿风味和品质密切相关。火腿成熟过程主要受到两方面因素影响，一方面是经过腌制和晾晒阶段后的肌肉中含盐量，不同的含盐量对发酵影响较大，另一方面是发酵环境的温湿度及控制，这是影响发酵成败的关键因素，而这两类因素主要通过对火腿区系微生物产生作用进而影响产品品质。在火腿微生物多样性分析结果中表明细菌中的葡萄球菌属和霉菌中的曲霉菌属在火腿的发酵过程中作为优势菌发挥重要作用，另外具有蛋白质分解活性的芽孢杆菌属也在火腿中被发现，可能与其他优势菌种一起对多肽的产生发挥作用[49-50]。干腌火腿中微生物多样性丰富且在不同温湿度环境下存在较大差异，其与火腿的理化性质存在一定的相关性，但微生物与肌肉内源酶、肌肉蛋白质的互作影响机理尚待深入研究，因此微生物对肽的形成影响是未来功能微生物挖掘研究的重要方向。

综上所述，微生物对于干腌火腿风味尤其是挥发性风味物质的形成起着重要的作用，而且两者的相关性已有较多文献支撑，但是干腌火腿中微生物与呈味肽的关系、微生物与生物活性肽的关系有待进一步研究证实，除此之外，充分发挥微生物的作用、探索新工艺实现功能性肽的富集，将具有非常高的应用价值，在未来具有广阔的市场。

3 结语

干腌火腿在加工过程中产生许多具有生理活性或为产品提供滋味的功能性肽，生理活性如抗氧化、降血压、抗菌以及降血糖、抗炎症等，对于生物活性肽的研究很多，目前集中在肽的功能特性研究、分离纯化鉴定以及人工合成方向，为干腌火腿产品提供滋味的呈味肽包括鲜味肽、甜味肽、苦味肽、酸味肽、咸味肽及浓厚感肽这六大类，且多为寡肽，目前研究集中在该类肽的呈味机理和人工合成方向。

火腿中内源酶和外源微生物的共同作用促进了肌肉蛋白质的降解，研究表明肌原纤维蛋白是加工过程中降解程度最高的蛋白质，也是许多生物活性肽的重要来源。火腿中内源酶的研究成果较多，国内外学者通过蛋白酶的提取、活力测定和体外试验等方法阐明了加工过程中组织蛋白酶B、D、H和L以及钙激活蛋白酶的活性变化规律以及作用机理，但针对特定功能性肽的形成机理解释有待更加深入研究。火腿区系微生物的研究目前集中在微生物多样性的分析以及通过基因来推测微生物功能与产品品质的关系，在发酵鱼制品中微生物对产品滋味的作用得到了证实，然而对于微生物的作用机理尚不清楚，火腿中功能性肽与微生物的相关性尚未有文献报道。

干腌火腿是深受国内外消费者喜爱的食品，但当今世界倡导低脂、低糖、降盐的健康饮食，给这种高盐的传统干腌产品带来了冲击，低钠盐火腿正成为科研工作者面临的新课题，通过改进加工工艺在保持火腿原有的风味与卫生指标基础上，研发低钠盐腌制技术。近三十年的国内外研究表明干腌火腿具有非常高的营养和潜在利用价值，因此在低钠盐火腿的研究基础上实现功能性肽富集的工艺设计，具有广阔的市场应用前景。同时，应在对干腌火腿功能性肽进行功能分类和结构鉴定的基础之上，结合现代组学技术，深入探究内源酶活性规律，阐明干腌火腿在加工过程中功能性肽形成的内源酶机理并探索分析火腿区系微生物对功能性肽形成的贡献度，为进一步开展特定功能微生物挖掘研究提供理论基础。